術前外周血單個核細胞微RNA-192對孤立性肝細胞癌微血管侵犯的預測價值

丁雪梅，武世倫，孫文兵

1 首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院 健康體檢中心，北京 100038;2 首都醫科大學附屬北京朝陽醫院西區 肝膽胰脾外科，北京 100043

目前，肝細胞癌(以下簡稱肝癌)病死率位居腫瘤相關性死亡第2位，僅次于肺癌[1]。肝癌的治療首選方式仍以手術治療為主，但由于肝癌易復發以及轉移，患者預后情況仍然較差[2]。研究[3]認為，微血管侵犯(microvascular invasion，MVI)是肝癌患者術后復發以及影響患者術后生存率的一個獨立危險因素。目前，對于MVI的診斷主要依靠術后病理檢查，因此尋求術前無創、有效的MVI預測工具，對于患者手術方式以及術后治療方案的選擇具有重要價值。外周血單個核細胞微RNA(miRNA，miR)的檢測作為近年來關注的焦點，成為臨床診斷和預后預測的無創檢測方法之一。miRNA屬于非蛋白質編碼的小分子RNA，miR-192基因位于11號染色體，在肝臟、結腸、腎臟等組織中表達。研究[4]顯示，miR-192與多種腫瘤的發生發展及患者預后密切相關。另有研究[5]發現，miR-192在腫瘤進展以及血管侵襲方面具有重要的調控作用。為了進一步提高對肝癌患者術后MVI預測準確性，本研究探討分析術前外周血單個核細胞miR-192對孤立性肝癌血管侵犯的預測價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2018年3月—2020年4月在北京朝陽醫院西區肝膽胰脾外科接受治療的肝癌患者136例，其中男78例、女58例，年齡34～79歲，平均(53.82±11.98)歲。根據術后病理檢查有無MVI分為MVI組(n=41)和非MVI組(n=95)。

1.2 納入標準及排除標準 納入標準：(1)術前B超、CT和/或MRI檢查診斷為肝癌，且無肝外轉移灶，并經術后病理證實；(2)均為首次行根治性切除術治療，術前未接受任何放療、化療以及其他治療方式；(3)術中切緣距腫瘤邊緣至少1 cm以上，且切緣陰性；(4)患者術前影像學檢查未見大血管侵犯；(5)臨床資料及影像學資料完整。排除標準：(1)全身狀況差，肝功能Child-Pugh C級；(2)術前合并全身感染；(3)合并其他原發性惡性腫瘤。

1.3 術前外周血單個核細胞miR-192檢測 術前抽取患者外周血4 ml，使用EDTA-K2抗凝，使用淋巴細胞分離液分離出外周血單個核細胞(PBMC)，使用PBS沖洗2次，將700 μl Qizol加入PBMC中混勻備用。使用Trizol試劑提取PBMC中總RNA，然后使用逆轉錄試劑盒將其轉錄為cDNA，然后按照SYBR Green EXScript TMPCR Kit操作程序進行PCR擴增，使用U6作為內參基因。miR-192以及U6引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。PCR反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s、60 ℃退火延伸20 s，共完成40個循環。使用2-△△Ct計算miR-192相對表達量。

1.4 術前超聲檢查 采用LOGIQ E9型彩色多普勒超聲診斷儀，超聲探頭頻率3.5～5.5 MHz，檢查時取仰臥位，對患者肝臟、脾臟等臟器各切面進行常規掃查，測量腫瘤的直徑，并記錄腫瘤結節類型以及包膜情況。結節包括3種類型：類圓型、單結節型以及多結節型；包膜分為3種：包膜完整、包膜缺損以及無包膜。由2位高年資醫師單獨閱片后給出診斷結果，若結果不一致，則由上述2位醫師商討復核后達成一致。

1.5 MVI判斷方法 參照《原發性肝癌規范化病理診斷指南(2015年版)》[6]明確術中病理取材部位以及數量，對標本進行固定硬化后切成薄片，將其制成病理切片并進行HE染色封片，在顯微鏡下觀察是否有MVI，即微小靜脈(包括門靜脈分支、中央靜脈或包膜外小靜脈)內漂浮成團癌細胞，并且周邊有明確的血管內皮細胞環繞。

1.6 倫理學審查 本研究由經北京朝陽醫院倫理委員會批準同意，批號：2018HL006。患者均簽署知情同意書。

2 結果

2.1 MVI組與非MVI組患者外周血單個核細胞miR-192水平比較 MVI組患者術前外周血單個核細胞miR-192相對表達量明顯低于非MVI組，差異有統計學意義(0.798±0.164 vs 1.086±0.215，t=7.663，P<0.001)。

2.2 影響MVI發生的單因素分析 對可能影響MVI發生的各因素進行單因素分析，結果顯示：腫瘤直徑、結節類型、包膜類型與MVI發生有關(t=3.828、χ2=5.422、χ2=5.914，P值均<0.05)(表2)。

表2 MVI發生單因素分析

2.3 影響MVI發生的多因素分析 將單因素分析有統計學意義的因素納入多因素logistic回歸分析，結果顯示：術前miR-192(OR=3.999，95%CI: 1.585～10.086，P=0.003)、結節類型(OR=3.241，95%CI: 1.154～9.106，P=0.026)以及包膜類型(OR=2.776，95%CI: 1.088～7.084，P=0.033)是影響肝癌患者MVI發生的獨立危險因素，即術前miR-192偏低、多結節以及無包膜將增加MVI的發生風險(表3)。

表3 多因素logistic回歸分析

2.4 外周血單個核細胞miR-192對MVI預測價值 采用ROC曲線分析患者術前外周血單個核細胞miR-192對MVI預測價值，結果顯示：曲線下面積為0.872，敏感度為68.38%，特異度為70.59%，95%CI: 0.768～0.931，最佳截斷值為0.858(圖1)。

圖1 術前外周血單個核細胞miR-192預測MVI的ROC曲線結果

3 討論

隨著現代分子生物學的發展和進步，研究者們對肝癌的認識不斷深入，以往僅關注于腫瘤數目、大小以及肝外轉移、肉眼可見癌栓等，而現在，越來越多的學者關注于MVI，并進入了微觀腫瘤世界的研究[7]。研究[8]認為，MVI是影響肝癌早期復發的重要因素之一，而長期以來，臨床一直忽略MVI的診斷，且并未將其列入肝癌病理診斷常規指標，也沒有統一的診斷標準。《原發性肝癌規范化病理診斷指南(2015年版)》[6]首次提出MVI診斷標準及其取材要求，同時也明確MVI是一個病理學概念。MVI以癌旁肝靜脈或門靜脈細小分支為主，可侵犯膽管、肝動脈以及淋巴管分支，目前文獻[9-10]報道肝癌患者MVI發生率在21%～63%。研究[11-12]認為，MVI是癌細胞逐步破壞周圍組織的一個過程，具體可將其分為3個步驟：(1)癌細胞克隆性增生；(2)癌細胞侵犯周圍基質、侵入微血管、破壞內皮細胞、形成微癌栓；(3)癌栓進一步增大、脫落和轉移。微血管是肝癌發生轉移的一個重要通道，MVI預示著腫瘤的轉移，因此微血管被認為是腫瘤轉移第一站。

miR-192基因多在肝臟、結腸以及腎臟等組織器官中表達，研究[13-14]顯示，miR-192在多種腫瘤組織中表達水平顯著降低，被稱為腫瘤異質性miRNA。miR-192在腫瘤組織以及正常組織中的差異性表達可用于惡性腫瘤的早期診斷，同時miR-192在腫瘤轉移、分期以及患者預后判定等過程中均有重要意義[15-16]。本研究著眼于分析術前外周血單個核細胞miR-192對孤立性肝癌MVI的預測價值。

本研究結果顯示，MVI組患者術前外周血單個核細胞miR-192相對表達量顯著低于非MVI組。與既往報道[17-18]結果相似。miR-192作為一種抑癌基因，其表達與惡性腫瘤患者腫瘤轉移的發生有關，同時miR-192可能是肝癌MVI發生的調控基因之一。單因素及多因素logistic回歸分析結果顯示，術前超聲影像特征(包括結節類型和包膜類型)以及miR-192水平均為MVI的獨立危險因素，提示術前miR-192水平與MVI之間具有密切的聯系。此外，采用ROC曲線進一步分析術前外周血miR-192相對表達量對MVI的預測價值，結果顯示，曲線下面積為0.872，提示術前外周血單個核細胞miR-192水平檢測對肝癌患者MVI具有較高的預測價值。對于術前預測MVI發生風險高的患者，提示其術后復發的風險較高，可以給予針對性的靶向、免疫、介入治療等，密切監測患者miR-192變化，從而降低復發風險，改善患者臨床預后。

隨著現代生物醫學技術的不斷發展，外周血單個核細胞miRNA檢測受到了越來越多研究者的關注，作為一種無創的檢測方式，可為疾病的診斷和預后預測提供更多的支持[19-20]。但是由于本研究納入樣本量較小，且并未針對分析不同指標之間聯合應用是否能夠提高診斷效能，因此下一步研究還需要擴大樣本量，并對其可能的機制及最佳的診斷預測方案進行分析。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：丁雪梅負責課題設計，資料分析，撰寫論文；武世倫負責收集數據，修改論文；孫文兵負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。