環狀RNA hsa_circ_0091579對肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

于維凱，馮婷婷，陳曉兵，駱繼業，馮萬文，王言理

1 連云港市第一人民醫院 急診內科，江蘇 連云港 222000；2 連云港市市立東方醫院 骨科，江蘇 連云港 222042

肝細胞癌(HCC)是一種常見的惡性腫瘤，位居全球第三大癌癥相關死亡原因[1]，具有侵襲性、預后差、治療機會有限的臨床特點。目前，手術是HCC最常見的治療方式，但很多HCC發現時已是晚期，無法進行手術切除，導致患者預后很差[2]。因此，進一步了解HCC進展的分子機制，尋找有效的治療靶點具有重要意義。

越來越多的證據[3-4]表明，環狀RNA(circular RNA，circRNA)失調在多種腫瘤的發生和發展中發揮重要作用。circRNA是一類內源性非編碼RNA，具有高度保守性；與線性RNA相比，它具有共價閉合環結構，因而比較穩定且不易被RNA外切酶降解[5-6]。circRNAs廣泛存在于真核生物體內，具有基因調控潛能，從而參與了增殖、侵襲、遷移、自噬、凋亡和代謝等多種細胞生物學進程[7-9]。據報道[10-11]，circRNAs在很多疾病中異常表達，參與了這些疾病的進展，并與預后密切相關。隨著高通量測序和生物信息學的發展，許多circRNAs被發現在HCC中異常表達，可作為HCC的生物學標志物，并參與了HCC的發生與發展[12-14]。

Zhang等[15]研究發現，hsa_circ_0091579可能在HCC進展中起到關鍵作用，并可能作為HCC患者預后的潛在生物標志物。然而，在HCC中，并無hsa_circ_0091579相關功能及機制研究。因此，本研究在HCC細胞系中檢測hsa_circ_0091579的表達，并探索其對HCC細胞增殖和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養及轉染 體外培養購買于ATCC公司的人HCC細胞系SMMC-7721、HuH-7、MHCC-97H、HepG2和人正常肝細胞系HL-7702。培養基為含10%胎牛血清(Gibco，USA)的DMEM高糖培養基(Gibco)。培養于37 ℃、5% CO2的環境中。采用Lipofectamine 3000試劑(Invitrogen，USA)將hsa_circ_0091579 siRNA及陰性對照(negative control，NC)轉染入細胞內，使用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)評估轉染效率。

1.2 RNA提取及qRT-PCR 根據說明書，使用Trizol試劑(Invitrogen)從細胞中提取總RNA，并使用分光光度計測定RNA的純度和濃度。取1 μg總RNA，采用PrimeScript-RT試劑盒(Takara Bio，Japan)將RNA逆轉錄成cDNA。以DNA為模板，使用SYBR Select Master Mix試劑盒(Applied Biosystems，USA)及ABI Prism 7900檢測系統(Applied Biosystems)進行qRT-PCR反應。hsa_circ_0091579的表達以GAPDH為內參，采用2-△△Ct法計算相對表達量。

1.3 CCK8細胞增殖實驗 細胞增殖能力采用CCK-8實驗進行分析。細胞以5×103/孔的密度接種于96孔板，并轉染siRNA，在37 ℃、5% CO2的環境中培養。轉染24、48或72 h后，將10 μl CCK-8試劑(Transgen Biotech，USA)添加至每個孔中，并在37 ℃下孵育1 h。根據說明書在450 nm波長下測量吸光度。

1.4 細胞凋亡實驗 細胞凋亡采用流式細胞術進行分析。將細胞接種于培養板中，培養24 h后進行轉染。轉染48 h后收集細胞，用PBS洗滌，并使用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(Solarbio)對細胞進行雙重染色，用FlowJo軟件分析細胞凋亡率。

1.5 細胞遷移實驗 通過細胞劃痕實驗研究細胞遷移能力。將細胞接種于6孔板，培養24 h后進行轉染。用10 μl無菌吸頭尖劃傷單層細胞制造劃痕，用PBS洗滌細胞3次以沖掉劃下的細胞。加入無血清的DMEM高糖培養基置于細胞培養箱中繼續培養24 h。使用光學顯微鏡對0 h和24 h的劃痕進行拍照記錄，計算細胞遷移率。

1.6 細胞侵襲實驗 使用Transwell小室(Thermo Fisher Scientific)研究細胞侵襲能力。轉染后的細胞消化并用無血清的DMEM培養基重懸，添加到涂有基質膠的Transwell上室，下室加入含有10%血清的DMEM培養基。小室置于細胞培養箱中培養24 h后，輕輕去除膜上的細胞，膜下的細胞用甲醇固定，結晶紫染色并計數。

1.7 靶點預測及熒光素酶報告基因實驗 使用Circular RNA Interactome (https://circinteractome.nia.nih.gov/index.html)數據庫對hsa_circ_0091579的靶microRNA(miRNA)進行預測。利用pmirGLO載體(Promega)分別構建野生型(wt)和突變型(mut)熒光素酶報告基因質粒。將熒光素酶報告基因質粒和miRNA mimics共轉染入HepG2細胞，用雙熒光素酶報告基因系統(Promega)測定熒光素酶活性。

2 結果

2.1 hsa_circ_0091579在HCC細胞系中的表達 通過qRT-PCR檢測了人HCC細胞系和人正常肝細胞系中hsa_circ_0091579的表達情況，并進行了對比。結果顯示，人HCC細胞系SMMC-7721、HuH-7、MHCC-97H、HepG2中hsa_circ_0091579的表達水平明顯高于人正常肝細胞系HL-7702，差異均有統計學意義(t值分別為14.27、36.34、26.70、36.16，P值均<0.001)(圖1)。

注：與HL-7702組比較，*P<0.05。

2.2 hsa_circ_0091579 siRNA設計及轉染 針對hsa_circ_0091579的環化拼接位點設計siRNA，siRNA靶序列為ACCAGAGGCCTTTGAAATTGT(圖2a)，qRT-PCR結果顯示，在HepG2和HuH-7細胞中轉染hsa_circ_0091579 siRNA能夠明顯降低hsa_circ_0091579的表達水平(t值分別為14.22、27.20，P值分別為0.005、0.001)(圖2b)。

注：a，hsa_circ_0091579 siRNA 靶序列；b，qRT-PCR驗證在HepG2和HuH-7細胞中轉染降低hsa_circ_0091579。與NC組比較，*P<0.05。

2.3 沉默hsa_circ_0091579對HCC細胞增殖和凋亡的影響 在HepG2和HuH-7細胞中轉染hsa_circ_0091579 siRNA，CCK8實驗和流式細胞術結果顯示，與NC組相比，沉默hsa_circ_0091579能夠在48 h和72 h明顯抑制HepG2和HuH-7細胞的增殖活性(P值均<0.05)(圖3)，并能夠明顯加速HepG2和HuH-7細胞的凋亡(t值分別為9.50、25.89，P值分別為0.011、0.002)(圖4)。

注：與NC組比較，*P<0.05。

2.4 沉默hsa_circ_0091579對HCC細胞遷移和侵襲的影響 劃痕實驗和Transwell實驗結果顯示，與NC組相比，沉默hsa_circ_0091579能夠明顯抑制HepG2和HuH-7細胞的遷移和侵襲能力(t值分別為19.63、13.61、20.75、18.45，P值分別為0.003、0.005、0.002、0.003)(圖5、6)。

2.5 hsa_circ_0091579靶miRNAs預測及驗證 通過Circular RNA Interactome數據庫，發現miR-149、miR-490-5p和miR-502-5p可能是hsa_circ_0091579的靶miRNAs。熒光素酶報告基因實驗結果顯示，與NC組相比，miR-149、miR-490-5p和miR-502-5p均能明顯降低野生型熒光素酶質粒的活性(t值分別為10.01、9.13、61.49，P值分別為0.010、0.012、<0.001)(圖7)。

3 討論

到目前為止，HCC進展的機制仍不清楚，然而，越來越多的證據[16-17]表明，HCC的發生可能是由HBV感染、癌基因激活、抑癌基因失活所引起。近年來，非編碼RNA已成為肝癌研究的熱點。一些研究[18-19]已表明腫瘤特異性非編碼RNA可以應用于生存預測和治療干預。部分異常調控的miRNAs和長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs, lncRNAs)是HCC耐藥性形成的重要調節因子，腫瘤特異性miRNAs和lncRNAs可作為HCC新的治療靶點和預后標志物[20]。

注:a,HepG2；b，HuH-7。與NC組比較，*P<0.05。

注：a,HepG2；b,HuH-7。與NC組比較，*P<0.05。

在與HCC相關的非編碼RNA中，circRNA日益受到關注[21-22]。例如，異常表達circRNAs可用于區分HCC和健康人群，預測患者預后，并與腫瘤大小、分化程度、微血管浸潤、轉移、TNM分期及甲胎蛋白水平等臨床因素密切相關，提示異常表達的circRNAs可作為一種新的HCC診斷和預后的無創生物標志物[23]。circABCB10在HCC組織和細胞系中的表達明顯增加，并通過調節miR-670-3p/HMG20A軸促進HCC的進展，可能是HCC的潛在治療靶點[24]。circ-0003418在HCC組織和細胞株表達下調，具有抗肝癌作用，通過抑制Wnt/β-catenin途徑促進HCC細胞的增殖、遷移和侵襲，并提高HCC細胞對順鉑的敏感性[25]。

注：與NC組比較，*P<0.05。

本研究選取了hsa_circ_0091579作為研究對象。2018年，Zhang等[15]使用circRNA微陣列分析檢測了3例HCC伴癌栓患者腫瘤組織和配對正常肝組織中circRNA的表達譜，發現hsa_circ_0091579在癌組織中高表達；隨后他們用qRT-PCR在75對腫瘤組織和配對正常肝組織中進行了驗證，并進一步發現hsa_circ_0091579的高表達與HCC患者總體生存率差密切相關；但他們并沒有對hsa_circ_0091579在HCC細胞系中的表達和功能做進一步研究。在此基礎上，筆者推測hsa_circ_0091579可能在HCC的發生和進展過程中發揮重要的作用，因而做了進一步探索。本研究結果顯示，hsa_circ_0091579在HCC細胞系中同樣高表達，這與其在人體組織中的高表達相符。進一步的功能實驗表明，在體外通過siRNA沉默hsa_circ_0091579后，HCC細胞的增殖、遷移和侵襲活性明顯降低，凋亡明顯加快。因此，筆者認為hsa_circ_0091579可發揮癌基因的作用促進HCC進展，此結果也可解釋Zhang等[15]研究所報道的hsa_circ_0091579高表達能夠影響HCC患者生存率。

在多種癌癥中，circRNAs發揮其功能的一個重要機制是靶向結合部分腫瘤相關miRNAs，并抑制這些miRNAs的功能[26]。本研究中，通過生物信息學預測發現miR-149、miR-490-5p和miR-502-5p可能是hsa_circ_0091579的靶miRNAs，并通過熒光素酶報告基因實驗進行了驗證。已有研究[27-29]證實miR-149、miR-490-5p和miR-502-5p在HCC中發揮抑癌基因的作用，抑制腫瘤進展。因此，筆者認為hsa_circ_0091579可能通過抑制上述具有抑癌作用的miRNAs發揮其癌基因的作用。

綜上，本研究結果表明，hsa_circ_0091579在HCC細胞系中高表達；在體外HCC細胞系中沉默hsa_circ_0091579能夠抑制HCC細胞的增殖、遷移和侵襲。hsa_circ_0091579可能通過抑制miR-149、miR-490-5p和miR-502-5p發揮癌基因的作用，其有希望成為有效的臨床治療靶點用于HCC的治療。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：于維凱、馮婷婷、馮萬文負責課題設計，資料分析，撰寫論文；陳曉兵、駱繼業參與收集數據，修改論文；于維凱、王言理負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。