靶向共價閉合環(huán)狀DNA抗HBV治療的研究進展

王藝穎，劉熙稱，樸榮利，秦俊杰

吉林大學第一醫(yī)院 肝病科，長春 130000

HBV感染已成為全球嚴重衛(wèi)生問題，全球慢性乙型肝炎(CHB)患者已達2.57億，其顯著增加肝硬化、肝衰竭和肝細胞癌的罹患風險。2017年全球肝炎報告顯示，每年約有65萬人死于HBV感染，給人們乃至社會帶來了沉重負擔[1]。1965年由Blumberg等[2]發(fā)現(xiàn)的HBV，隨后被證實為一種具有內源性DNA聚合酶活性的DNA病毒。1982年，Summers等[3]研究發(fā)現(xiàn)HBV聚合酶將RNA中間體逆轉錄為不完整且松弛的環(huán)狀DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)，這一環(huán)狀DNA隨后轉化為共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)，形成病毒轉錄的模板，并居于宿主細胞核中。這些突破性的發(fā)現(xiàn)開創(chuàng)了HBV分子生物學時代，重組HBV疫苗的開發(fā)隨之拉開序幕。據(jù)報道[1,4]，世界范圍內的預防性疫苗接種計劃已明顯降低5歲以下兒童的HBV患病率。當前用于HBV感染的標準療法包括聚乙二醇化干擾素α和核苷酸類藥物(NAs)[5]。自1998年以來，已經(jīng)批準了6種NAs應用于臨床實踐中，包括拉米夫定、恩替卡韋、替比夫定、阿德福韋酯及替諾福韋[6],但所面臨的巨大考驗也不容忽視：首先，IFNα對cccDNA轉錄的長期和可持續(xù)抑制具有重要作用，但干擾素的應答率欠佳；其次，NAs可以通過靶向病毒RNA依賴性DNA聚合酶來抑制HBV復制，但對現(xiàn)有的cccDNA微染色體沒有直接影響，NAs終止后常見病毒復發(fā)，甚至在達到治療終點的患者中亦如此[7]。盡管使用IFNα和NAs已觀察到有效的抗病毒應答，但目前仍無法完全清除cccDNA，為徹底治愈HBV感染，迫切需要根除肝內cccDNA的新治療策略[8-10]。本文對關于cccDNA的當前知識及其作為治療靶標的潛在作用作一綜述,旨在探索消除病毒cccDNA潛在治療策略的前景及曙光。

1 HBV的身世之謎

1.1 HBV的生命周期——cccDNA的持續(xù)性 肝細胞是HBV易感染的靶細胞之一，HBV通過血液到達肝臟感染肝細胞。HBV與位于宿主肝細胞上的硫酸肝素蛋白聚糖相互作用，牛磺膽酸鈉共轉運多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)與之結合進入肝細胞[6](圖1步驟-1),隨后帶有rcDNA的核衣殼(圖1步驟-2)被釋放到細胞質中并進入細胞核,進入核內的rcDNA利用宿主DNA修復機制轉化為高度穩(wěn)定的游離DNA，即cccDNA[11-12](圖1步驟-3)。cccDNA被轉錄為HBV前基因組RNA(pregenomicRNA，pgRNA)和幾個亞基因組RNA[13](圖1步驟-4)。HBV DNA整合感染肝細胞后立即進入宿主基因組[14]。完成轉錄和翻譯后(圖1步驟-5)，pgRNA被包裝并組裝在核衣殼中(圖1步驟-6)，并被轉錄成松弛的環(huán)狀DNA(圖1步驟-7)，最后成熟的衣殼，即含有rcDNA的衣殼，可以通過細胞分泌途徑，并以包膜和感染性病毒體的形式釋放[15]。重要的是，細胞內成熟衣殼中新形成的后代rcDNA(圖1步驟-8)，如來自傳入病毒體的rcDNA，也可以被遞送至宿主細胞核并啟動額外cccDNA分子的形成，從而有助于病毒的持久性[7,16]。

圖1 HBV復制周期示意圖[4,17-18]

1.2 HBV的基因組信息 HBV基因組呈環(huán)狀結構，含內部核衣殼核心的外部脂蛋白包裹部分雙鏈的DNA[16]。 HBV DNA長度僅為3.2 kb，包含4個重疊的開放閱讀框，分別為S、C、P和X。cccDNA纏繞在組蛋白上形成病毒微染色體，是所有病毒RNA轉錄物(pg、preS、S和X)編碼七種蛋白質的獨特模板(圖1步驟-5)：pgRNA充當病毒聚合酶介導的逆轉錄和rcDNA后續(xù)合成的模板；HBcAg是另一種基因產(chǎn)物核心蛋白，它參與病毒核衣殼的構成；此外前核心蛋白(HBeAg)是一種蛋白水解加工的病毒蛋白。HBsAg是所有不同長度的表面蛋白的統(tǒng)稱,其中包括病毒表面蛋白S、M和L(其中S從S mRNA進行翻譯,M從preS2+ S mRNA進行翻譯,L從preS1+PreS2+S mRNA進行翻譯)。最后,cccDNA還編碼一種非結構蛋白即病毒蛋白X(HBV regulatory X，HBx)，可能起轉錄反式激活因子的作用，并在調節(jié)病毒基因表達中發(fā)揮作用。

據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，HBV DNA也可整合到宿主染色體中。病毒DNA的整合似乎在病毒復制的過程中并沒有發(fā)揮直接作用，但有報道[14]發(fā)現(xiàn),HBV DNA整合可能通過調節(jié)基因表達使細胞環(huán)境更易于病毒復制，可能在肝細胞癌變中起重要作用。目前有關cccDNA的大多數(shù)知識都來自于鴨DHBV模型，cccDNA研究的主要障礙之一是缺乏可靠的、可量化的體外培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)無法生成真正的HBV cccDNA。有研究[19]發(fā)現(xiàn)HepG2-HBV/loxP細胞系統(tǒng)在研究cccDNA相關生物學機制和開發(fā)新型cccDNA靶向藥物方面具有強大的潛力。

2 消除cccDNA的新策略

目前使用NAs的抗病毒療法靶向病毒聚合酶并抑制逆轉錄。它們阻止病毒基因組rcDNA的合成，以防止成熟衣殼的形成和傳染性子代病毒的釋放，從而通過細胞內cccDNA擴增來減少cccDNA的補充。但是，NAs不能靶向已建立的cccDNA，因此不能治愈慢性HBV感染。

2.1 基于DNA損傷修復機制的設想 宿主細胞DNA損傷修復機制將rcDNA識別為損傷的DNA，并介導其轉化為cccDNA[20]。近年來有報道[21]稱,酪氨酰DNA磷酸二酯酶2(Tyrosyl DNA phosphodiesterase 2 )及FEN1(flap structure-specific endonuclease 1)，在cccDNA形成的過程中扮演重要角色，除了進行實際的DNA修復反應以從rcDNA形成HBV cccDNA的酶促機制外，其他包括調節(jié)HBc磷酸化狀態(tài)以及衣殼核導入和脫殼的宿主蛋白激酶與磷酸酶等宿主因素，可能也參與控制cccDNA的形成。但是，由于迄今確定的與cccDNA形成有關的宿主因子也與許多基本細胞過程有關，考慮到潛在的嚴重副作用，它們似乎不太可能作為治療靶標[7]。

在細胞核中，與cccDNA微型染色體結合的HBx蛋白可在表觀遺傳上發(fā)揮其影響，同時啟動并維持cccDNA的轉錄。HBx參與DNA修復途徑，宿主蛋白損傷特異性DNA結合蛋白1(damage-specific DNA-binding protein 1,DDB1)與其結合,對于病毒復制尤為重要[22]，通過募集含有DDB1的E3泛素連接酶以降解宿主限制因子SMC5/6(structural maintenance of chromosomes 5/6)，以允許cccDNA進行HBV轉錄，否則將被轉錄抑制[5]。鑒于其在HBV生命周期中的重要作用，除了影響表觀遺傳轉錄并刺激眾多細胞轉導途徑外，靶向HBx成為一種可行的治療策略。硝唑尼特[2-乙酰氧基-N-(5-硝基-2-噻唑基)苯甲酰胺]是一種口服的噻唑類抗感染藥。Sekiba等[23]通過化合物篩選用于藥物重新定位的方法發(fā)現(xiàn)硝唑尼特顯著抑制HBx-DDB1相互作用，從而抑制了病毒轉錄、蛋白質表達和cccDNA水平，為HBV提供新的治療選擇。

2.2 通過基因編輯技術沉默cccDNA表達 鋅指核酸酶(zinc fingernucleases，ZFN)、轉錄激活子樣效應子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)和成簇的規(guī)則間隔的短回文重復序列/CRISPR相關(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated Cas9 nucleases，CRISPR/Cas9)系統(tǒng)等基因組編輯技術可以有效地破壞HBV cccDNA[24-27]。DNA將來自四種不同物種的CRISPR/Cas9系統(tǒng)與靶向HBV基因組保守區(qū)域的指導RNA在細胞系中共表達，發(fā)現(xiàn)源于化膿性鏈球菌(streptococcus pyogenes，Sp)和嗜熱鏈球菌(streptococcus thermophilus，St)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過靶向HBV基因組的保守區(qū)域，從而阻斷了HBV復制，同時超過90%的HBV cccDNA轉染6 d后被降解。研究發(fā)現(xiàn)HBV cccDNA甲基化影響CRISPR/Cas9的抗病毒活性，而單核苷酸HBV遺傳變異不會影響St CRISPR/Cas9的抗HBV活性，表明其可用于靶向許多HBV變異。而兩個或多個錯配會破壞或阻斷CRISPR/Cas9活性，使其宿主DNA不太可能成為靶向。最重要的是，深度測序表明Sp CRISPR/Cas9引起脫靶誘變，而St CRISPR/Cas9對宿主基因組沒有影響，St CRISPR/Cas9系統(tǒng)代表了具有高抗HBV活性的最安全的系統(tǒng)[28]。

ZFN作為一種DNA核酸內切酶，具有基因組編輯潛能，可用于在特定的靶位點介導DNA雙鏈發(fā)生斷裂反應，并在裂解位點處產(chǎn)生序列改變而發(fā)揮修復作用[24]。Weber等[29]設計了3種靶向HBV聚合酶，基因X和核心的ZFN，并分別通過自身互補的腺相關病毒載體將其分別導入HepAD38細胞,實驗中發(fā)現(xiàn)這些針對HBV的ZFN可以有效抑制HBV主動復制，并抑制HBV持久性的細胞模板。TALEN與ZFN相似，但TALEN的DNA結合結構域是高度重復的，并且源自轉錄激活因子樣III效應子。2013年發(fā)現(xiàn)TALEN可以降低細胞培養(yǎng)物中HBV產(chǎn)生的效率[30]。隨后研究人員使用TALEN介導的同源性定向重組將人工初級miRNA引入HBV基因組可以提高TALEN的抗病毒效力[31]。

2.3 通過表觀遺傳修飾沉默cccDNA轉錄 表觀遺傳學研究的重點是基因表達的調控機制，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑和非編碼RNA干擾等。HBV cccDNA以組蛋白修飾的微染色體的多個拷貝形式存在于細胞核中，因此所有這些調節(jié)機制都會影響HBV復制和持續(xù)感染[6]。IFNα通過募集組蛋白脫乙酰基酶1(histone deacetylase 1，HDAC1)減少與cccDNA結合的乙酰化組蛋白H3來降低HBV cccDNA轉錄活性[32]。shRNA(short hairpin RNA)可以誘導HBV cccDNA甲基化，從而抑制其在人肝癌細胞中的轉錄[33]。NIRF(Np95/ICBP90-like RING finger protei)一種新型的E3泛素連接酶，可使轉染了pAAV-HBV1.3的HepG2細胞中的HBV DNA復制，HBsAg和HBeAg的分泌受到抑制作用。此外，NIRF還能對表達HBV的小鼠模型中HBV的復制和分泌起到抑制作用。NIRF減少HBV cccDNA結合的H3組蛋白的乙酰化。這些結果表明，不僅可以通過與HBc直接相互作用抑制HBV復制，還能減少與H3組蛋白的乙酰化[34]。姜黃素可通過下調cccDNA結合的組蛋白乙酰化來抑制HBV復制[35]。沉默類視黃醇X受體α會導致cccDNA形成和病毒抗原產(chǎn)生升高，而它的激活會降低HBV感染效率[36]。DNA甲基化和組蛋白乙酰化是cccDNA形成所必需的，這些共同的發(fā)現(xiàn)表明，對其調控可使cccDNA轉錄失活，從而抑制HBV復制[6]。Yuan等[37]的研究進一步表明組蛋白脫乙酰基酶11特異性降低了cccDNA結合的組蛋白H3的乙酰化水平，通過cccDNA轉錄的表觀遺傳抑制作用來阻斷HBV復制，為抗HBV藥物的開發(fā)提供了重要參考。

3 未來展望

經(jīng)過幾代人的努力，在HBV的各個方面都取得了不容忽視的進步，不僅發(fā)現(xiàn)了可以有效抑制病毒復制的預防性疫苗和抗病毒藥物，并且?guī)追N新穎的抗HBV治療藥物正在臨床前開發(fā)或早期臨床試驗中[7,38](表1)。但完全消除核cccDNA仍遙遙無期，主要的努力仍然是致力于開發(fā)能夠清除或沉默HBV cccDNA的有限療法[39]。基因編輯的進展，特別是CRISPR-Cas9技術，這是唯一已知能破壞先前存在的cccDNA，但脫靶和體內遞送方法等問題仍面臨著巨大考驗。盡管基于基因編輯和基于表觀遺傳修飾的策略都需要克服挑戰(zhàn)，并且從基礎研究到臨床應用還有很長的路要走，但卻已顯示出光明的前景。

表1 新研發(fā)的抗HBV感染的代表藥物

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：王藝穎負責資料分析、撰寫論文；劉熙稱負責收集數(shù)據(jù)，修改論文；樸榮利負責課題設計、擬定寫作思路；秦俊杰負責撰寫文章并最后定稿。