CDK抑制劑(AT7519)對小鼠急性肝損傷的保護作用

劉彥君 黃鶴鳴 付榮 石翠翠 范建高 張元元 羅成 李光明

AT7519作為新型的細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)抑制劑，可有效抑制CDK2、CDK5、CDK9的活性，促進中性粒細胞凋亡，并已在包括急性呼吸窘迫綜合征在內等多種肺炎癥模型中表現出了抗炎活性[1-3]。研究表明，氧化應激和炎癥反應在肝損傷病理進程中起重要作用，抑制炎癥反應或氧化應激可作為緩解急性肝損傷(acute liver injury, ALI)的潛在治療方式[4,5]。因此，AT7519可能通過緩解炎癥反應對肝損傷起保護作用。CCl4誘導的ALI模型現階段被廣泛應用于評估肝毒性和藥物研發的相關實驗研究中，CCl4可通過細胞色素P450尤其是CYP2E1，進行生物轉化從而生成過氧化自由基，繼而攻擊肝細胞膜導致肝細胞壞死[6]。本研究旨在通過建立CCl4誘導的ALI模型，觀察AT7519對肝損傷的保護作用，并對其作用機制進行初步探討。

材料和方法

一、實驗動物、實驗藥物與試劑

SPF級C57BL/6雄性小鼠30只，6～8周齡，體重19～21 g，由中國科學院上海藥物研究所提供，標準動物飼料及飲水，飼養于12 h明暗交替環境下，適應1周后進行實驗。所有動物實驗均通過中國科學院上海藥物研究所動物倫理委員會批準。

AT7519購自美國MedChemExpress公司；CCl4購自上海國藥集團化學有限公司；橄欖油購自上海生工生物工程股份有限公司；LPS(E.Coli，菌株 O111:B4)購自美國Sigma公司。蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin， HE)和F4/80、LY-6G免疫組化染色試劑盒購自武漢谷歌生物科技有限公司。RNA提取、反轉錄試劑，以及RT-qPCR熒光染料試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

二、細胞培養及細胞炎癥模型構建

小鼠巨噬細胞系RAW264.7來自中國科學院上海藥物研究所，使用培養基為高糖DMEM+10%胎牛血清(Gibco澳洲胎牛血清)+1%雙抗(鏈霉素、青霉素)，置于體積分數為0.05的CO2、37℃培養箱中生長。RAW264.7細胞以約1×106個細胞/mL的密度種于6孔板中，過夜貼壁后，分別以20 μmol、10 μmol、5 μmol不同濃度的AT7519預處理1 h后，再加入終濃度為1 μg/mL的LPS繼續培養4 h收樣。

三、實驗動物與CCl4急性肝損傷模型的建立

將30只小鼠隨機分成3組，正常對照組、模型組及藥物干預組各10只。CCl4急性肝損傷模型通過單次腹腔注射10% CCl4(由橄欖油稀釋)2 mL/kg誘導構建[7]。藥物干預組接受AT7519 10 mg/kg腹腔注射2次，給藥間隔24 h，第2次給藥2 h后腹腔注射10% CCl4溶液。模型組給予等量0.9% NaCl溶液腹腔注射2次，間隔24 h，第2次注射2 h后腹腔注射10% CCl4溶液。正常對照組均接受等量0.9% NaCl溶液腹腔注射。在CCl4誘導刺激48 h后，用10%水合氯醛麻醉小鼠并取血及肝臟。

各組小鼠全血經4 ℃ 3 000 r/min離心15 min分離血清，保存于-80℃備用。部分肝組織置于4%多聚甲醛中固定24 h，常規石蠟包埋、切片；其余部分肝組織液氮速凍后保存于-80℃備用。

四、血清生化指標檢測

使用Hitachi 7020全自動生化分析儀，檢測血清ALT、AST。

五、肝組織染色

將石蠟包埋的肝組織常規制備切片，并行HE染色。免疫組化染色使用F4/80抗體(1∶100，MAB5580，RD)及LY-6G抗體(1∶100，MAB1037-100，RD)根據標準步驟進行染色。

六、 肝組織及RAW264.7細胞因子mRNA水平檢測

LPS誘導鼠巨噬細胞RAW264.7常被用作細胞炎癥模型，可評估化合物抑制炎癥反應的效果。IL-6、IL-1β和TNF-α 作為經典的促炎性細胞因子，其表達水平可反映炎癥的嚴重程度[8]。以20 μmol、10 μmol、5 μmol不同濃度的AT7519分別預處理RAW264.7細胞1 h，再給予LPS 1 μg/mL處理4 h后，RT-qPCR檢測IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA水平。

取適量肝組織研磨后，使用RNA抽提試劑盒提取總RNA；細胞實驗結束后吸棄培養基，用1×PBS清洗2遍。總RNA使用Naonodrop2000儀器測定，并用Hiscript q-RT SuperMix for qPCR試劑盒進行反轉錄。反轉錄所得cDNA用ChamQ SYBR Qpcr Master試劑盒進行RT-qPCR熒光定量檢測肝組織表達的細胞因子水平。選取Gapdh為內參，數據使用2-△△CT法進行分析。所有引物均由上海擎科生物科技有限公司合成。引物序列如下： IL-6正向為CTGCAAGAGACTTCCATCCAG，反向為AGTG-GTATAGACAGGTCTGTTGG；IL-1β正向為GAA-ATGCCACCTTTTGACAGTG，反向為TGGAT-GCTCTCATCAGGACAG；Tnf-α正向為CAGGCG-GTGCCTATGTCTC，反向為CGATCACCCCGA-AGTTCAGTAG；Gapdh正向為AGGTCGGTG-TGAACGGATTTG，反向為TGTAGACCATG-TAGTTGAGGTCA。

七、統計學方法

結 果

一、AT7519對LPS誘導RAW264.7細胞炎癥相關基因mRNA水平的影響

與對照組相比，模型組IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，不同濃度AT7519預處理組其表達水平均顯著降低(P<0.05)，且其抑制炎性細胞因子的效果呈劑量依賴性，見表1。

二、AT7519對小鼠急性CCl4肝損傷肝組織病理學表現的影響

正常對照組小鼠肝細胞結構正常，肝小葉結構完整，未見病理改變；模型組小鼠肝細胞大片壞死，有較多點狀或灶性壞死，并伴有大量炎性細胞浸潤；藥物干預組小鼠肝臟病理改變顯著減輕，壞死灶較少，并且炎性細胞浸潤明顯改善，肝組織結構基本正常(圖1)。進一步利用免疫組化方法檢測各組小鼠炎性細胞浸潤情況，F4/80檢測肝組織巨噬細胞數量，LY-6G檢測肝組織中性粒細胞數量。染色結果顯示，與正常對照組相比，模型組F4/80和LY-6G棕黃色陽性細胞數量均明顯增多；而藥物干預組與模型組相比，其肝組織內F4/80和LY-6G陽性細胞數量顯著減少(圖2)。表明AT7519對CCl4誘導的ALI具有保護作用，并可減輕該模型中的炎癥反應。

表1 AT7519對RAW264.7細胞促炎細胞因子表達的影響(±s)

圖1 各組小鼠肝組織HE染色病理學表現(低倍放大) A 正常對照組；B 模型組；C 藥物干預組

圖2 各組小鼠肝組織F4/80及LY-6G免疫組化染色結果(低倍放大) A、D 正常對照組；B、E 模型組；C、F 藥物干預組

三、3組小鼠ALT和AST水平的比較

與正常對照組相比，模型組小鼠血清ALT、AST水平顯著升高(P<0.05)，提示造模成功CCl4可誘導小鼠肝功能受損；而AT7519干預組血清ALT、AST水平顯著低于造模組，差異有統計學意義(P<0.05)，表明AT7519對該模型中肝損傷具有保護作用，見表2。

表2 各組小鼠ALT和AST水平(±s)

四、AT7519對小鼠急性CCl4肝損傷肝組織細胞因子mRNA水平的影響

RT-qPCR結果顯示，CCl4模型組小鼠肝組織內IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA表達水平較正常對照組顯著升高(P<0.05)，經AT7519干預后上述促炎細胞因子mRNA水平顯著降低(P<0.05)，見表3。上述結果表明AT7519可有效抑制急性CCl4肝損傷模型中肝組織炎性細胞因子表達，從而減輕炎癥反應緩解肝損傷。

表3 各組小鼠肝組織細胞因子mRNA水平(±s)

討 論

炎癥反應可導致繼發炎性介質分泌參與隨后的細胞防御及組織修復，因而炎癥反應終止在恢復組織穩態及功能的過程中起重要作用[9,10]。持續存在或反復發生的炎癥反應可促進肝星狀細胞激活最終導致纖維化，甚至肝癌[11-13]。因此，調控炎癥反應在肝臟疾病進展中可能起到保護作用。

細胞實驗證明，在LPS誘導的鼠巨噬RAW264.7細胞炎癥模型中，AT7519可顯著減少LPS誘導的炎性細胞因子表達水平，且其效果呈劑量依賴性。基于炎癥反應在ALI進展中的關鍵作用及AT7519的抗炎作用，本研究進一步探究了AT7519對小鼠ALI的保護作用。CCl4誘導的ALI特點為肝小葉中央壞死，伴有血清轉氨酶水平顯著升高等[14]。本研究從組織病理及血清生化水平等方面，驗證了AT7519可顯著減輕CCl4所致ALI。此外，從炎癥因子表達上也證實了AT7519可有效抑制CCl4刺激導致的炎癥反應過度激活。

本研究從體內、體外實驗分別證實了AT7519的抗炎作用，且可顯著對抗小鼠CCl4誘導的ALI。其保護機制可能與減輕炎性細胞浸潤、抑制炎性細胞因子分泌有關，從而減輕小鼠肝損傷中的炎癥反應并起到保護作用。目前，臨床尚缺乏針對ALI的有效治療藥物，AT7519的肝臟保護作用提示其可作為潛在的候選治療藥物。