長鏈非編碼RNA CCAT1可作為肝細胞癌血漿標志物并預測其治療效果

張彬彬 郁皓 曹斐 吳曉霞 單永鋒 王昊楠 劉慧

常用的篩查肝細胞癌(HCC)的手段是AFP檢測聯合超聲多普勒檢查，然而，AFP檢測早期HCC的敏感度只有39%～65%[1]。目前眾多的lncRNA在腫瘤患者血清中被發現高表達，預測其可能作為腫瘤的診斷標志物[2-7]。結腸癌相關轉錄因子1(colon cancer associated transcript 1，CCAT1)被發現在結直腸癌、胃癌、肝細胞癌、膽囊癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中高表達，并具有促進腫瘤增殖、侵襲和遷移的作用，并與腫瘤的不良預后相關，可作為潛在的預后標志物[4，8-11]。本研究首次檢測CCAT1在HCC患者血液中的表達水平，探索其作為診斷HCC的血液標志物的可能性，并研究其在HCC介入或射頻前后的表達水平。

材料與方法

一、研究對象

收集江蘇省無錫市第五人民醫院2017年到2019年期間66例肝癌患者血液標本，并收集50例年齡、性別相匹配的健康成人對照。其中肝癌組的37例患者經介入或射頻治療，并留取治療后1個月左右的血液標本。靜脈采血后2 h內3 000 r/min 4 ℃低溫離心15 min，收集血漿，分裝到離心管中，每管500 μL凍存在-80 ℃。所有樣本采集均得到患者知情同意。所有樣本使用取得無錫市第五人民醫院倫理委員會同意及支持。

二、RNA提取及實時定量PCR

TRIzol LS Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 被用來提取血漿總RNA，具體步驟根據產品說明書。RNA被逆轉錄為cDNA應用HiScript III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(Vazyme，南京，中國)。使用Fast Probe Mixture(CWBIO，北京，中國)進行定量PCR反應，2 μL cDNA被用來作為反應模板。反應條件：95 ℃ 10 min預變性，隨后95 ℃ 15 s變性，65 ℃ 1 min擴增，共40個循環。β-actin被作為內源性標志物。引物序列如下: CCAT1, 5′-CATTGGGA-AAGGTGCCGAGA-3′ (sense) and 5′-ACGCTTAGCC-ATACAGAGCC-3′ (anti-sense)；β-actin, 5′-TCCTCTC-CCAAGTCCACACA-3′ (sense) and 5′-GCACGAAG-GCTCATCATTCA-3′ (anti-sense)。

三、統計學分析

應用SPSS18.0軟件用來分析數據，采用U檢驗比較各組血漿CCAT1水平。分組資料分析采用卡方檢驗。應用ROC曲線評價血漿CCAT1對HCC的診斷價值。P<0.05被認為具有統計學價值。

結 果

一、HCC患者血漿CCAT1表達水平增加及其診斷價值

采用逆轉錄PCR法檢測各組血漿CCAT1的相對表達情況并進行分析，結果顯示，66例HCC患者血漿CCAT1表達水平明顯高于50例健康志愿者(P=0.016)。

通過ROC曲線分析來評估血清CCAT1是否可以作為HCC的潛在生物標志物。結果表明，血漿CCAT1可區分HCC患者與正常對照組，其ROC曲線下面積為0.782(95%CI：0.692～0.873，P<0.001)。在截斷值為0.010 3時，敏感度和特異度分別為68.6%和69.8%，對HCC的診斷有一定的價值。

二、HCC患者經治療后血漿CCAT1表達水平較前下降

37例HCC患者經射頻消融或肝動脈介入化療后檢測血漿中CCAT1表達水平，結果表明，CCAT1表達較治療前下降(P=0.003)，揭示了CCAT1的表達水平的變化可能作為判斷HCC治療效果的血液標志物。

三、CCAT1的表達水平及其與HCC臨床病理參數的相關性

研究表明，多種在HCC組織中異常表達的lncRNA呈現出與腫瘤患者臨床病理參數之間的相關性，因此我們分析了血漿中CCAT1的表達水平與HCC患者臨床病理特點之間的關系。根據CCAT1的中位表達水平將所有患者分為低表達組和高表達組，如表1所示，血漿中CCAT1的表達水平與HCC患者的BCLC分期相關，BCLC分期越高，則CCAT1的表達水平越高。CCTA1的表達水平與HCC患者的性別、年齡、腫瘤數目、腫瘤大小、Child分級、AFP水平未表現出明顯關系。

表1 66例肝癌患者血漿中CCAT1的表達水平

討 論

截至目前，HCC的發生機制仍未完全闡明。眾多研究報道，多種lncRNA均參與HCC的發生、發展，例如lncRNA TUG1、CASC9、HULC、PTTG3P等[12-14]。最新研究發現，CCAT1在HCC組織中高表達，其通過與miR-181a競爭性結合調節HCC細胞的增殖及自噬[15]。另有研究發現，CCAT1在結直腸癌患者的血液中高表達，其與HOTAIR聯合檢測用于預測結直腸癌的患病率其敏感度及特異度均較高[4]，這表明CCAT1可在腫瘤患者血液中穩定表達。本研究旨在探討CCAT1在HCC患者血漿中的表達水平，并分析其作為HCC血液標志物及治療評估標志物的可能性。

本研究檢測了66例HCC患者與50例健康成年人血漿中CCAT1的表達水平，發現CCAT1在HCC患者血漿中的表達水平較高，且患者的BCLC分期越高，則CCAT1的表達水平越高，這表明檢測血漿CCAT1的表達水平可能可以區分HCC患者及健康成年人，其表達水平越高，則提示病情越晚，這對HCC的診斷及病情判斷有一定的價值。66例HCC患者中，有37例患者是行射頻或介入治療的，比較了治療前與治療后1個月左右CCAT1的表達水平，結果顯示，經射頻或介入治療后CCAT1的表達水平明顯下降，提示CCAT1可能作為預測HCC治療效果的腫瘤標志物。本研究亦存在許多需進一步完善之處，后續應擴大樣本量，延長隨訪時間，盡量取得相同患者不同時間點的血液標本，橫向比較CCAT1在整個病程中的變化，及其與生存時間的相關性。

綜上所述，本研究提示CCAT1可作為HCC的血液標志物，并可預測其治療效果。