VAP患者下呼吸道分離CRKP的臨床及分子生物學流行特征

劉 周，儲雯雯，李 昕，汪雅婷，周 強

(安徽醫科大學第二附屬醫院檢驗科，安徽 合肥 230601)

隨著社會人口老齡化的日益加劇，慢性疾病患者不斷增加，使得呼吸支持的臨床應用日益廣泛。由于多種因素的影響，接受呼吸機治療的臨床患者往往會繼發呼吸機相關肺炎(ventilator-associa-ted pneumoniae，VAP)[1]。VAP是指氣管插管或氣管切開患者接受機械通氣48 h后或撤機拔管48 h內發生的肺炎，是重癥患者常見的嚴重并發癥，更是常見醫院獲得性感染，其臨床診療較為困難，且患者病死率高[1-2]。耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌是VAP的重要病原體，其中耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)是重要組成之一[2-4]。CRKP不僅呈現出多重耐藥，近年來更進化出攜帶pLVPK-like毒力質粒的耐碳青霉烯類高毒力肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistance hypervirulentKlebsiella.pneumoniae，CR-hvKP)，嚴重威脅醫院感染的防控效果[5]。目前，新型冠狀病毒全球蔓延，患者感染后主要受累器官是肺，病情危重時大多需接受機械通氣治療[6]。為提高救治成功率，預防多重耐藥菌導致的VAP是臨床診療及醫院感染防控中一項重要工作。因此，收集2019年1—12月某地區省級綜合性三甲醫院VAP患者下呼吸道標本分離的CRKP菌株，分析其感染與耐藥情況、基因分型及毒力因子特征，為其醫院感染防控提供實驗室循證依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2019年1—12月某地區某三甲醫院VAP患者下呼吸道合格標本分離的非重復肺炎克雷伯菌(KP)，共計75株。

1.2 臨床資料的收集 VAP診斷標準按照《中國成人醫院獲得性肺炎與呼吸機相關肺炎診斷和治療指南(2018版)》[2]進行。剔除機械通氣之前已發生肺部感染者，機械通氣治療48 h內出院或48 h內死亡以及臨床資料不完整患者分離的菌株。最終納入本研究共計56株KP。收集患者的基本臨床資料，包括性別、年齡、基礎疾病、機械通氣時間、入住ICU時間及臨床轉歸。本研究通過該院倫理委員會審查同意。

1.3 菌株鑒定及藥敏試驗 采用Microflex LT型質譜儀(德國BRUKER公司)進行菌株鑒定。阿米卡星、氨芐西林/舒巴坦、氨曲南、厄他培南、環丙沙星、哌拉西林/他唑巴坦、慶大霉素、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、妥布霉素、亞胺培南及左氧氟沙星采用VITEK 2 Compact型分析儀(法國BioMérieux公司)進行藥敏檢測；美羅培南及頭孢哌酮/舒巴坦采用紙片擴散法進行藥敏檢測，紙片為美國ThermoFisher公司產品。替加環素(美國Pfizer公司)應用微量肉湯稀釋法進行藥敏檢測，結果按EUCAST標準(http://www.eucast.org)判定，其他藥敏結果按美國臨床實驗室標準化協會(CLSI) 2019版標準判定[7]。將對亞胺培南、美羅培南及厄他培南三者任意一種耐藥的KP定義為CRKP[7]，對上述三種藥物均不耐藥的KP定義為碳青霉烯非耐藥KP(non-carbapenem-resistant KP， nCRKP)。

1.4 碳青霉烯酶表型及耐藥基因檢測 采用改良碳青霉烯滅活試驗(mCIM)及EDTA改良滅活試驗(eCIM)檢測碳青霉烯酶表型[7]。煮沸法提取CRKP菌株DNA模板，聚合酶鏈反應(PCR)檢測常見碳青霉烯酶基因blaKPC-2、blaNDM-1、blaIMP、blaVIM、blaOXA-48，引物序列及擴增條件參照文獻[8]。擴增產物用含EB(0.2 μg/mL)1%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像觀察結果。陽性產物送Sangon Biotech公司進行測序，測序結果在GenBank數據庫中比對查詢。

1.5 莢膜wzi分型及毒力基因檢測 煮沸法提取待測KP菌株DNA模板，PCR擴增wzi基因，引物序列及擴增條件參考文獻[9]。擴增產物送Sangon Biotech公司測序后，登錄Web數據庫(https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/)比對wzi型及相應莢膜血清型。擴增9種主要毒力因子(包括rmpA、rmpA2、iucA、iroN、entB、magA、mrkD、Kfu及ybtS)，引物序列及擴增條件參考文獻[10-11]進行。擴增產物用含EB(0.2 μg/mL)1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像觀察結果。挑選代表性陽性結果送Sangon Biotech公司測序，比對確認后作為陽性對照。

1.6 多位點序列分型 參照多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST)網站(https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/primers_used.html)推薦序列合成7對管家基因檢測PCR引物。擴增條件參考文獻[8]。PCR產物送Sangon Biotech公司測序，登錄Web數據庫(https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/)比對序列，明確待測菌株ST型。按照gapA-infB-mdh-pgi-phoE-rpoB-tonB順序整理等位基因，并根據等位基因差異，將ST型分為單位點變異型(single-locus variants, SLVs)、雙位點變異型(double-locus variants, DLVs)及三位點變異型(triple-locus variants，TLVs)。應用Global optimal eBURST(goeBURST)軟件分析各ST間的進化發育關系并構建最小生成樹，確定ST型中的group founder及sub-group founder，將group founder及其SLVs(兩種及以上)定義為克隆群(clonal complex， CC)[12]。

1.7 脈沖場凝膠電泳(PFGE) 待測CRKP菌株接種于2 mL LB肉湯管，37℃震蕩培養4 h，離心后用EC液混勻。加入等體積2%低熔點瓊脂糖凝膠，混勻后注入模具制成膠塊。膠塊置蛋白酶K于50℃水浴過夜后，1×TE清洗4～6次。膠塊切至5 mm大小后XbaI酶37℃酶切4 h。電泳條件為：0.5×TBE、14℃、6 V/cm、線性梯度5～35 s、22 h。染色成像后使用BioNumerics軟件分析。PFGE圖譜相似性>90%定義為同一分型(Pulsotype, PT)[13]。

2 結果

2.1 臨床基本特征 本研究56株KP中，CRKP 34株(60.7%，CRKP組)，nCRKP 22株(39.3%，nCRKP組)。CRKP組患者以男性為主(70.6%)，平均年齡(62.3±16.4)歲。CRKP組患者所在臨床科室包括：綜合重癥監護病房A(ICU_A，13株，38.2%)、呼吸重癥監護病房(ICU_R，8株，23.5%)、綜合重癥監護病房B(ICU_B，6株，17.6%)，神經外科(3株，8.8%)、急診重癥監護病房(ICU_E，2株，5.9%)及呼吸內科和骨科(各1株，2.9%)。與nCRKP組相比，CRKP組患者在年齡、性別、接受外科手術、機械通氣時間及基礎疾病方面差異均無統計學意義。但CRKP組入住ICU日數≥20 d比例高于nCRKP組，同時死亡及自動出院患者的比例高于nCRKP組(均P<0.05)，治療病情好轉比例低于nCRKP組(P<0.01)。見表1。

表1 CRKP及nCRKP組VAP患者臨床基本特征

2.2 藥敏試驗及耐藥檢測結果 體外藥敏試驗結果顯示，CRKP組菌株對常用抗菌藥物耐藥率高于nCRKP組(均P<0.05)。CRKP對頭孢菌素類及碳青霉烯類抗生素的耐藥率均為100.0%，僅對氨曲南耐藥率為97.1%，對環丙沙星及左氧氟沙星耐藥率均為94.1%；對阿米卡星、妥布霉素及慶大霉素的耐藥率分別為70.6%、94.1%、94.1%。未檢出耐替加環素的菌株。見表2。經mCIM和eCIM檢測，97.1%(33株)CRKP 菌株mCIM試驗為陽性，2.9%(1株)菌株eCIM為陽性。PCR檢測表明，mCIM陽性菌株均攜帶blaKPC-2，eCIM陽性株攜帶blaNDM-1。

表2 CRKP組及nCRKP組菌株對抗菌藥物耐藥率(%)

2.3 MLST及PFGE分型 MLST結果顯示，34株CRKP菌株共分為6個ST型，主要為ST11(82.4%)；22株nCRKP菌株分為8個ST型，主要為ST11(45.4%)。見表3。GoeBURST分析可見，CRKP菌株中，ST11及ST15均為sub-group founder，ST340為ST11的SLVs，ST14為ST15的SLVs，且ST15為ST11的TLVs；nCRKP菌株中，ST23為group founder，ST218與ST1265均為ST23的SLVs，ST111和ST412均為ST23的TLVs。ST23和ST218、ST1265共同構成CC23。見圖1。進一步通過PFGE分析顯示，34株CRKP分為26個PT型，其中PT05、PT15、PT16、PT18和PT20型菌株分別為2、3、4、2、2株，且PT15及PT16型克隆株主要分布在ICU_A病區。見圖2。

表3 CRKP組及nCRKP組菌株MLST結果

注：每個節點代表一個ST型，節點大小與該ST型菌株數量成正比。黃色節點為group founder，綠色節點為sub-group founder，紫色節點為common node。節點間藍色連線提示兩ST型為SLVs、黑色連線提示為DLVs、灰色連線提示為TLVs、無連線提示該ST型與其他型差異大于3個位點。

2.4 莢膜wzi分型及毒力因子分析 莢膜wzi分型可見，CRKP菌株共分為5種莢膜型，以K64型為主(50.0%)，其次為K47型(38.3%)；nCRKP菌株則分為7種，以K47為主(40.9%)。K64型菌株在CRKP菌株中的比例高于nCRKP菌株(P<0.01)，且PT05、PT15及PT16型CRKP菌株莢膜均屬于K64型。毒力因子檢測結果顯示，CRKP菌株攜帶多種毒力因子，其中pLVPK-like質粒介導的毒力因子rmpA、rmpA2、iucA及iroN檢出率分別為17.6%、44.1%、44.1%及47.1%，而rmpA2、iucA及iroN的檢出率高于nCRKP菌株(均P<0.05)，上述質粒介導的毒力因子主要由K64-ST11型CRKP菌株攜帶。見表4、圖2。

注：Carba為carbapenemase; ND為no detection; Neuro為neurosurgery; Orth為orthopedics; pLV為pLVPK-like plasmid; PT為pulsotype; Resp為respiratory medicine; ST為sequence type; VF為virulence factor;* Date中日期格式為MM-DD。

表4 CRKP及nCRKP菌株莢膜分型及毒力因子檢測結果

3 討論

作為臨床常見條件致病菌，KP易于獲得外源耐藥基因并出現耐藥表型，是醫院感染重點防控的多重耐藥菌。根據全國細菌耐藥監測網統計數據[14]顯示，我國CRKP檢出率逐年攀升，從2013年的4.9%上升至2018年的10.1%，臨床流行趨勢十分嚴峻。本研究56株KP中，CRKP的比率高達60.7%，與感染患者均存在ICU住院史有關。與我國某三甲醫院2018年ICU CRKP臨床分離率為63.7%，且主要來源于呼吸道標本的研究[15]結果基本一致。本組資料中CRKP組患者入住ICU日數≥20 d的比例高于nCRKP組，進一步提示ICU是CRKP流行播散的重點科室。

入住ICU患者大多患有嚴重基礎疾病，一旦繼發CRKP感染，往往預后不良。研究[16]表明，感染CRKP患者病死率遠高于感染非耐藥株患者。本研究中，CRKP 組與nCRKP組VAP患者在年齡、性別及基礎疾病種類方面差異均無統計學意義，但其死亡及自動出院患者比例遠高于nCRKP組。其CRKP菌株呈現多重耐藥表型，對除替加環素之外的所有臨床常用抗菌藥物耐藥率均高于70%；所有菌株均產碳青霉烯酶，且以KPC-2為主。KPC-2屬于A類絲氨酸β-內酰胺酶，其臨床流行范圍最廣泛，通常由質粒攜帶在腸桿菌目細菌間水平傳播[17]。此類質粒常同時攜帶多種耐藥基因，導致CRKP菌株表現為多重耐藥，給臨床抗感染治療帶來極大挑戰[17]。因此，嚴格落實醫院感染防控措施，預防VAP患者發生CRKP感染更顯得尤為重要。

ST11型是中國大陸地區CRKP的主要流行克隆群，占比在60%以上[17]。比較基因組學研究[18]表明，由于包括莢膜多糖合成位點在內的基因組片段發生的重組，導致該型出現不同的進化分支，從而呈現不同的莢膜分型。本研究中，ST11型CRKP菌株共分成K64和K47兩種莢膜型，以K64型為主，且K64型CRKP的構成比高于nCRKP組(P<0.05)。2013—2017年浙江地區一項回顧性研究發現，K64-ST11型CRKP在2016年取代了K47型，成為主要流行亞克隆。通過毒力因子檢測發現，CRKP菌株攜帶的毒力因子比例較高，且其中rmpA2、iucA及iroN檢出率高于nCRKP菌株[19]。上述三種毒力因子均由pLVPK-like毒力質粒攜帶，是CR-hvKP的重要分子標志[5]。而攜帶pLVPK-like質粒的K64型亞克隆，更易于在醫院環境中存活[19]。本研究PFGE分型結果顯示，出現3例以上克隆傳播的PT15和PT16型，均屬于K64型ST11-CRKP，提示該亞克隆在醫院環境中具有較強的定植及播撒能力，可能與攜帶pLVPK-like質粒后毒力增強相關。另一方面，由于本研究納入研究的菌株及病例數量較少，且菌株來源為單中心，研究結果存在一定的局限性。后續將繼續擴充研究中心并增加菌株數量，系統分析攜帶pLVPK-like質粒與CRKP菌株醫院內定植播撒之間的關聯性。

綜上所述，本研究結果顯示，K64-ST11型CRKP是臨床VAP患者下呼吸道分離CRKP重要分子亞克隆。不僅表現為多重耐藥，而且攜帶大量由pLVPK-like質粒介導的毒力因子。與對照組相比，CRKP組患者臨床預后不佳。應加強臨床、實驗室及感染管理部門的協作，密切監控K64型ST11-CRKP菌株亞克隆的流行趨勢，防控其導致的醫院感染事件發生。