PD-1/PD-L1與膿毒癥的免疫紊亂

張堯堯，張 永，李 言

(1. 蚌埠醫學院第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學科，安徽 蚌埠 233000； 2. 蚌埠醫學院病理生理教研室，安徽 蚌埠 233000)

膿毒癥(sepsis)的發病率逐年上升，已成為主要的公眾健康問題之一，也是全球重癥監護病房(ICU)非冠脈性疾病危重和死亡的主要原因，免疫紊亂是其最顯著特點，其中持續的免疫抑制更是成為當前新的研究熱點[1]。在膿毒癥住院患者中，病原體相關分子模式(PAMPs)及受損或壞死組織來源的損傷相關分子模式(DAMPs)被宿主模式識別受體(PRRs)識別，啟動相應的免疫反應。而適應性免疫系統可以通過控制或局限化損傷過程來保持免疫平衡狀態。這種促進和拮抗的調節異常時出現控制失衡，甚至引發“細胞因子風暴”(cytokine storm)[2]，誘發過度炎癥反應。雖然部分膿毒癥患者可以度過最初的炎癥風暴階段，但若免疫抑制持續存在將進一步增加醫院獲得性感染和病原體再活化的風險。而這種膿毒癥患者免疫抑制的重要機制就是程序性死亡受體1(programmed cell death protein-1,PD-1)與程序性死亡受體-配體1(programmed cell death ligand-1,PD-L1)途徑，其與T細胞、B細胞、中性粒細胞、MPS的活化增殖受到抑制及調節性T細胞(Treg)和MDSC等數量的增加密切相關，PD-1/PD-L1對膿毒癥患者免疫狀態以及疾病發展中的作用引起學界高度關注，但對于PD-1/PD-L1檢測作為免疫生物標志物和治療靶點的臨床價值并未能達成共識，尤其當免疫檢查點阻斷劑的相關抗體治療試驗及結果并未最終完成時[3-4]。

1 PD-1/PD-L1

PD-1(CD279)是CD28/CTLA-4/ICOS共刺激受體家族中對T細胞和B細胞免疫的關鍵成員，負責傳遞負性調節信號。PD-1由PDCD1基因編碼的單體I型跨膜糖蛋白，其結構包括胞外結構域——免疫球蛋白可變區(IgV)、跨膜結構域和胞質尾區，來共同執行細胞內信號傳導。PD-1屬于CD28家族成員[5-6]，當胞外段與其配體PD-L1結合后，胞內段免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif,ITIM)和轉換基序(immunoreceptor tyrosine-based switch motif,ITSM)主要發揮免疫抑制作用。PD-1與PD-L1的結合可以導致PD-1胞質尾部酪氨酸磷酸化，募集酪氨酸磷酸酶(SHP-2)直接拮抗T細胞受體(TCR)和CD28活化信號[7]。在癌癥免疫中發現，癌細胞表面PD-L1踩下“免疫剎車”，可以抑制免疫細胞活化，臨床試驗也發現該分子對于腫瘤具有逃避免疫攻擊的作用[8-9]。由于PD-L1在T細胞、B細胞、樹突狀細胞(DCs)、巨噬細胞(M)及其他非造血細胞上廣泛表達，而PD-L2表達受限，主要在DCs、M和B細胞上表達[10]，因此PD-1/PD-L1作為免疫診療的潛在靶點得到了更多的研究。Herbst等[11]研究發現PD-1抗體在晚期非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的二線治療中優于化學治療，且首次證實PD-L1表達水平可作為生物標志物預測PD-1抗體療效；但與此同時，也會因釋放自身反應性T細胞導致類風濕關節炎等自身免疫性疾病[12]。因此，PD-1/PD-L1在機體免疫中作用較復雜，了解其在膿毒癥中的免疫機制尤其重要。

2 膿毒癥與免疫

免疫炎癥紊亂是膿毒癥發生發展的核心機制，相關認識正在不斷深化。在正常情況下，所有活化的T細胞均表達PD-1，其作為一個“天然剎車”可以平衡T細胞的過度激活反應，參與免疫耐受。但在膿毒癥發生發展過程中，PD-1/PD-L1通路會對固有免疫及適應性免疫產生損傷，總體上發揮免疫抑制作用，見圖1。PD-1/PD-L1使中性粒細胞、DCs、單核細胞、吞噬細胞等產生功能障礙，不僅直接破壞固有免疫系統功能，作為抗原提呈細胞進一步阻礙適應性免疫應答；PD-1/PD-L1表達水平的升高還可直接增加T細胞耗竭和凋亡，增加Treg細胞的數量和抑制性功能，負向調節適應性免疫反應。簡言之，PD-1/PD-L1通路在膿毒癥的免疫抑制機制中作用獨特。

2.1 PD-1/PD-L1與T淋巴細胞 PD-1與PD-L1結合可以引起膿毒癥患者T細胞耗竭。T細胞活化需雙重信號刺激：其一為APCs的MHC-抗原肽識別TCR，其二為APCs表面的共刺激分子與T細胞表面相應配體相結合。這種雙重信號刺激實質上是一種故障-安全模式。CD28/B7相互作用傳導T細胞活化信號，PD-L1、PD-L2與B7-1、B7-2在結構上高度同源，所以又分別被命名為B7-H1和B7-H2，PD-1：PD-Ls通路為抑制T細胞激活的協同刺激信號，一方面參與宿主免疫耐受對阻止自身免疫性疾病的發生起到保護作用；另一方面通過引起T細胞耗竭而產生免疫抑制。膿毒癥T細胞耗竭主要表現為T細胞活化及增殖能力下降、凋亡增加和細胞因子減少：(1)調節性T細胞(Foxp3+Treg)數量增加，PD-1表達上調，同時APCs表面CD80/86表達下調，共同抑制T細胞活化增殖[13]，并且PD-1+Treg具有協助微生物逃避免疫監視的作用。Foxp3是Treg的關鍵轉錄調控因子，進入外周循環的原始CD4+T細胞可以通過TCR和PD-1與APCs上配體結合誘導其表達FoxP3，Francisco等[14]通過試驗發現PD-L1表達缺陷的APCs誘導CD4+T細胞向Treg表型轉變的能力最弱。(2)T淋巴細胞表面IL-7R減少，抑制性受體PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3等表達增加，IFN-γ等細胞因子分泌減少[15]，PD-1及配體(PD-L1、PD-L2)在眾多導致T細胞耗竭的機制中被認為發揮了關鍵作用[16-17]。此外，在TCR信號通路中，PD-1/PD-L1作用于中間分子如PI3K、Akt、ZAK-70和PKC-，從而干擾細胞信號的轉導并阻遏T細胞的活化與增殖[18]；PD-1/PD-L1軸還可經降低IL-2、大B細胞淋巴瘤抗凋亡因子的合成來間接抑制T細胞活化、增殖，進而促使T細胞凋亡[19]。PD-1/PD-L1軸的“免疫檢查點阻斷”對小鼠各種感染性、自身免疫等模型中的T細胞正向調控具有重要作用，在小鼠和人類發生膿毒癥48 h后，就可觀察到PD-1在CD4+和CD8+T細胞上的表達上調[20]；孔令宇等[21]研究發現膿毒癥患者經連續性腎替代治療(CRRT)好轉后，CD8+T細胞表面PD-1表達水平較治療前下降。如上所述，PD-1/PD-L1軸通過直接或間接耗竭T淋巴細胞抑制膿毒癥患者免疫應答，進而發生膿毒性休克(septic shock)甚至死亡。

PI3K：磷酸磷脂酰激酶-3羥激酶；ZAP70：ζ 鏈相關蛋白激酶70；SHP：酪氨酸磷酸酶。A：PD-1與PD-L1連接，ITSM募集的SHP通過ZAP-70或PI3K通路去磷酸化，抑制下游信號傳導，使CD4+T 細胞向Treg、Th2分化增多，CD8+T細胞耗竭、失能及抗炎因子白介素(IL)-10增加，M向M2分化增多；PD-1/PD-L1抗體、IL-7可以抑制T細胞耗竭，增加T細胞活化、增殖。B：中性粒細胞表面PD-1與內皮細胞表面PD-L1結合促進中性粒細胞流入肺泡腔。

2.2 PD-1/PD-L1與中性粒細胞 膿毒癥患者的中性粒細胞(PMNs)可通過PD-1/PD-L1通路抑制T細胞活化增殖。這一途徑主要因為膿毒癥急性期PD-L1+中性粒細胞即低密度中性粒細胞(low-density neutrophils,LDNs)大量增加。Huang等[22]根據免疫組化區分PMNs表面PD-1/PD-L1表達高(PD-L1high)低(PD-L1low)的亞群。Patera等[23]也發現PD-L1highPMNs表面CD168表達下降和TNF-α分泌減少，對于外來微生物的吞噬能力下降。Lomas-Neira等[24]在小鼠間接性急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)模型中發現中性粒細胞PD-1與內皮細胞表面PD-L1結合會破壞肺內皮細胞(EC)屏障，中性粒細胞流入肺泡增加，而PD-1/PD-L1基因敲除的小鼠EC屏障改善，支氣管肺泡灌洗液蛋白減少。總之，中性粒細胞PD-1和PD-L1表達增加與膿毒癥預后不良密切相關。

2.3 PD-1/PD-L1與單核巨噬細胞系統 單核巨噬細胞系統(mononuclear phagocytic system,MPS)包括單核細胞、M和DCs，在膿毒癥發展到晚期免疫抑制階段時，PD-1/PD-L1軸會使MPS發生細胞功能障礙，細胞向抑炎表型轉化。

2.3.2 PD-1/PD-L1與單核細胞 單核細胞是機體防御系統重要組成部分，感染時可以向M、DCs轉化，而PD-1/PD-L1通路參與調控單核細胞的功能。單核細胞可以通過Shao等[29]研究發現膿毒癥患者單核細胞PD-L1表達水平可以獨立預測28天死亡率，說明這一指標與膿毒癥疾病嚴重程度呈正相關。試驗發現膿毒癥晚期單核細胞通過缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)信號通路抑制促炎因子的產生，并誘導單核細胞上PD-L1蛋白表達上調，從而發生免疫抑制[30-31]；其中HIF-1α可以介導蛋白信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)使單核細胞發生功能障礙[32]。但是，單核細胞和T細胞的信號溝通機制尚需進一步了解。

2.3.3 PD-1/PD-L1與DCs DCs是重要的抗原提呈細胞之一，該細胞功能障礙在膿毒癥免疫抑制階段起關鍵作用。TIPE1是腫瘤壞死因子α誘導蛋白8(TnFAIP8)家族的新成員，與細胞死亡有一定關系。Luan等[33]試驗發現TIPE1負向調控DCs成熟和活化，TIPE1基因敲除的小鼠中DCs表面CD80、CD86、MHC-II表達上調，PD-1、PD-L1表達下調，這說明TIPE1基因可能通過PD-1/PD-L1通路發揮抑制DCs成熟活化及T細胞免疫反應的作用。DCs受到LPS和TNF-α刺激時細胞周期蛋白依賴性激酶5(CDK5)表達會增加，在腫瘤及慢性鼻竇炎中均發現CDK5參與調節免疫抑制基因，CDK5的增加可以上調DCs上PD-L1的表達水平[34-35]，但CDK5和PD-L1在膿毒癥中的聯系尚無結論。總而言之，PD-1/PD-L1通路使MPS細胞功能障礙，直接或間接導致膿毒癥發生免疫抑制。

3 抗PD-1/PD-L1療法與膿毒癥

膿毒癥初期機體受到抗原刺激，APCs表面的CD80/86、MHC-I/II分別與T細胞表面的CD28、TCR結合傳遞活化T細胞的第一及第二共刺激信號，T細胞活化增殖并消除外來微生物。但活化后的T細胞PD-1表達也會被激活，PD-1與PD-L1結合后會阻遏第二共刺激信號，誘導T細胞耗竭及凋亡，使機體發生免疫抑制。目前膿毒癥動物試驗大量展開，當下創建膿毒癥模型的兩種常用方法：LPS法和CLP法，動物模型通常采用成年大鼠。Huang等[25]研究發現PD-1基因敲除的大鼠較野生組存活率提高，試驗組大鼠M功能正常，細菌清除率改善，促炎細胞因子產生減少。鼠的免疫反應能否模擬人類炎癥性疾病(例如膿毒癥)存在爭議，Wakeley等[36]補充了有關人類患者的試驗，通過分析膿毒癥休克患者PD-1表達模式和細胞因子圖譜發現免疫細胞PD-1表達水平升高與IFN-γ、IL-4等分泌增加呈正相關，而這些細胞因子與Th1、Th2反應及細胞因子風暴密切相關，同時，APACHE II評分>20分與PD-1過表達有關的結論提示抗PD-1抗體作為膿毒癥的治療策略的可能性。Hotchkiss等[4]針對31例患有膿毒癥和總淋巴細胞減少癥(定義為絕對淋巴細胞計數≤1.1×103/μL)的成年患者進行了抗PD-1單克隆抗體納武單抗(nivolumab)的1b期平行組隨機對照試驗，雖然臨床觀察患者免疫力改善并不如腫瘤患者明顯，但是鼓舞人心的是這次臨床試驗并沒有發生嚴重不良事件(SAE)。同期24例成年膿毒癥患者進行的抗PD-L1抗體(BMS-936559)試驗已經結束，但結果尚未公布。雖然目前尚無SAE的相關報道，但是PD-1/PD-L1通路與膿毒癥治療的有效性和安全性還需更多試驗進一步驗證。

4 結語與展望

膿毒癥動物模型和臨床試驗提示在膿毒癥免疫抑制階段，PD-1/PD-Ls的過表達導致免疫細胞功能受到抑制，從而增加了膿毒癥患者的病死率。PD-1/PD-Ls不僅作用于抗原提呈細胞與淋巴細胞，還作用于抗原提呈細胞之間、免疫細胞與非免疫細胞之間，可能通過影響抵抗微生物免疫防御與免疫介導的組織損傷之間的平衡來影響病原體感染的結局。大量試驗發現免疫檢查點抑制劑(ICI)在許多惡性腫瘤中有一定治療效果，且抗PD-1、PD-L1抗體在治療膿毒癥的Ⅰb期臨床試驗已經開展，PD-1/PD-Ls及下游信號轉導過程中的分子可能成為膿毒癥新的診斷標志物和潛在治療靶點。而PD-1/PD-Ls在膿毒癥免疫抑制中的具體作用機制如PD-1/PD-Ls如何聯系固有免疫和適應性免疫、如何作用于非免疫細胞、PD-1/PD-Ls下游信號轉導途徑等許多問題尚不清楚，有待于進一步思考和研究。