產(chǎn)蛋白酶菌株P(guān)12 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化*

龔志立，曹 譽(yù)，劉 平，昂 學(xué)，劉 靜

（湖北大學(xué)知行學(xué)院，湖北 武漢 430011）

蛋白酶是能將蛋白質(zhì)水解為氨基酸或多肽的一類酶的總稱，在食品、醫(yī)藥、制革、洗滌、化工等方面有著廣泛的應(yīng)用[1]，占整個(gè)酶制劑的60%以上。蛋白酶的生產(chǎn)可從動(dòng)植物中提取，但酶得率較低，而微生物源蛋白酶因微生物生長繁殖速度快、提取工藝相對簡單更為經(jīng)濟(jì)，因此，尋找能夠高產(chǎn)蛋白酶的菌株對于蛋白酶的工業(yè)化生產(chǎn)至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)室初期從土壤中已經(jīng)篩選出產(chǎn)蛋白酶的菌株P(guān)12，經(jīng)鑒定為芽孢桿菌屬。本實(shí)驗(yàn)對分離出的這株野生型菌株進(jìn)行研究，通過調(diào)整培養(yǎng)條件和改良培養(yǎng)基配方以優(yōu)化產(chǎn)酶條件，彌補(bǔ)細(xì)菌對產(chǎn)蛋白酶研究的不足，同時(shí)本研究對擴(kuò)大微生物菌種資源的開發(fā)以及微生物蛋白酶的應(yīng)用，具有一定指導(dǎo)意義和實(shí)際意義。

1 材料與儀器

1.1 菌株

湖北大學(xué)知行學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室篩出的產(chǎn)蛋白酶芽抱桿菌P12。

1.2 主要試劑

干酪素 （分析純），天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；牛肉膏、蛋白胨 （均為生物試劑），上海盛思生化科技有限公司；瓊脂粉 （生物試劑），上海山浦化工有限公司；尿素、硫酸銨、硝酸鉀、氯化鈉 （均為分析純），天津市廣成化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖、乳糖、蔗糖 （均為分析純），上海展云化工有限公司；果糖 （生物試劑），上海展云化工有限公司。

1.3 主要儀器

7200 型可見分光光度計(jì)，上海尤尼科儀器有限公司；THZ-C 型恒溫?fù)u床，陜西鵬展科技有限公司；SW-CJ-ZD 型無菌操作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；DHP-9162 型恒溫培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.4 主要培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g/L，牛肉膏 3 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂粉15 g/L。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖15 g/L，牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌株的培養(yǎng)

將斜面保存菌株P(guān)12 用接種環(huán)取一環(huán)5 mg 接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進(jìn)行菌種活化，在轉(zhuǎn)速為180 r/min 的搖床、溫度為37 ℃的環(huán)境下培養(yǎng)16 h后，再以 1 mL 1%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，相同條件下培養(yǎng)2 d 后測定蛋白酶活力。

2.2 蛋白酶酶活力測定

2.2.1 酶活單位定義

在本實(shí)驗(yàn)中，每1mL 粗酶液，在28℃下，10min水解酪素產(chǎn)生1 μg 酪氨酸即為一個(gè)酶活力單位，以U/mL 表示[2]。

2.2.2 酶活測定方法

蛋白酶活力測定采用Folin 法[3]。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 碳源的選擇

分別取5 份種子培養(yǎng)液1 mL 接入含有不同碳源的100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中，即將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中1.5 g 1.5%的葡萄糖分別替換成1.5 g 1.5%的蔗糖、麥芽糖、乳糖和果糖，在溫度為37℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min 的搖床培養(yǎng)48 h。離心取上清得粗酶液，測定酶活力，確定最佳碳源[4]。

基于堆疊自編碼網(wǎng)絡(luò)的風(fēng)電機(jī)組發(fā)電機(jī)狀態(tài)監(jiān)測與故障診斷//趙洪山,劉輝海,劉宏楊,林酉闊//(11):102

2.3.2 氮源的選擇

分別取4 份種子培養(yǎng)液1 mL 接入含有最佳碳源和不同氮源的100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中，即將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中1 g 1%的蛋白胨分別替換成1 g 1%的尿素、(NH4)2SO4和KNO3，在溫度為37℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min 的搖床培養(yǎng)48 h。離心取上清得粗酶液，測定酶活力，確定最佳氮源[5]，最佳氮源為蛋白胨。

2.3.3 不同金屬離子對產(chǎn)酶的影響

將3 份1 mL 種子培養(yǎng)液分別接入含有優(yōu)化碳源、氮源的100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在發(fā)酵培養(yǎng)基中添分別添加50 mg 0.05%的MgSO4、0.05%的CaCl2和0.05%的FeSO4，在溫度為37℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min 的搖床培養(yǎng)48 h。離心取上清得粗酶液，測定酶活力，根據(jù)結(jié)果確定最適添加的金屬離子。

2.3.4 初始pH 值的確定

取5 份1 mL 種子培養(yǎng)液分別接入含優(yōu)化碳源、氮源和金屬離子的100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH 值分別為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，在溫度為37℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min 的搖床培養(yǎng)48 h。離心取上清得粗酶液，測定酶活力，確定最佳發(fā)酵初始pH 值。

2.3.5 發(fā)酵溫度的確定

取5 份1 mL 種子培養(yǎng)液分別接入含優(yōu)化碳源、氮源和金屬離子的100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基pH 值為7.0，設(shè)定培養(yǎng)溫度分別為28 ℃，33 ℃，37 ℃，42 ℃和 47 ℃，在轉(zhuǎn)速為 180 r/min 的搖床中培養(yǎng)48 h。離心取上清得粗酶液，測定酶活力，確定最佳發(fā)酵溫度。

2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以碳源、氮源、初始pH 值和發(fā)酵溫度作為4 個(gè)影響因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化發(fā)酵條件，見表1。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同碳源對菌株產(chǎn)酶的影響

選擇葡萄糖作為碳源時(shí)的酶活力最高，達(dá)到190 U/mL，蔗糖次之，而麥芽糖、乳糖和果糖作為碳源的酶活力較低，因此菌株P(guān)12 的最適碳源為葡萄糖。

表1 4 因素3 水平表

3.2 不同氮源對菌株產(chǎn)酶的影響

選擇蛋白胨作為氮源時(shí)的酶活力最高，達(dá)到201 U/mL，尿素、(NH4)2SO4和KNO3作為氮源的酶活力較低，因此菌株P(guān)12 的最適氮源為蛋白胨。

3.3 不同金屬離子對菌株產(chǎn)酶的影響

在培養(yǎng)基中加入MgSO4時(shí)的酶活力最高，達(dá)到207 U/mL，CaCl2和FeSO4的添加幾乎不影響菌株產(chǎn)酶能力。

3.4 不同初始pH 值對菌株產(chǎn)酶的影響

經(jīng)比較得出培養(yǎng)基的初始pH 值為7.0 的酶活力最高，達(dá)到210 U/mL。

3.5 不同發(fā)酵溫度對菌株產(chǎn)酶的影響

經(jīng)比較得出發(fā)酵溫度為37 ℃的酶活力最高，達(dá)到216 U/mL。

3.6 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 中，極差R 表示試驗(yàn)因素中對酶活力的影響大小，在4 個(gè)因素中，對產(chǎn)酶活性影響最大的是蛋白胨，其次為葡萄糖＞發(fā)酵溫度＞初始pH 值。由表2 分析得出，在A 因素葡萄糖添加量中，k 表示水平對應(yīng)所有評分的平均值，例如k1表示第1 水平對應(yīng)所有評分的平均值，k3最大，表示A 因素中第3水平最優(yōu)，依次類推，發(fā)酵條件的最優(yōu)組合為A3B3C3D1，但該組合并未在正交試驗(yàn)中出現(xiàn)。以A3B3C3D1 的組合進(jìn)一步驗(yàn)證，酶活力達(dá)到289 U/mL，高于A3B3C2D1 的組合，從而確定發(fā)酵條件的最優(yōu)組合為A3B3C3D1，即在2%的葡萄糖，1.2%的蛋白胨，初始pH 值為7.5，發(fā)酵溫度為35℃的條件下，發(fā)酵液酶活力最高。

4 結(jié)論

為了研究產(chǎn)蛋白酶菌株P(guān)12 的產(chǎn)酶影響因素，本實(shí)驗(yàn)首先通過對菌株生長需要的營養(yǎng)環(huán)境 （碳源、氮源）、溫度、初始pH 值等方面對產(chǎn)酶的影響進(jìn)行單因素分析，并在此基礎(chǔ)上做正交試驗(yàn)。最終得出，該菌株發(fā)酵溫度為35 ℃，初始pH 值為7.5，2%的葡萄糖、1.2%的蛋白胨、0.3%的牛肉膏、0.5%的NaCl、0.05%的MgSO4的組合培養(yǎng)基為最優(yōu)組合，發(fā)酵液酶活力達(dá)到289 U/mL。