經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈栓塞術(shù)聯(lián)合小干擾核糖核酸治療肝癌療效及對(duì)兔缺氧誘導(dǎo)因子-1、血管內(nèi)皮生長因子的影響

陳思攀，楊耀博，焦 陽，顏昭勇

(陜西省人民醫(yī)院介入放射科,陜西 西安 710068)

肝癌是我國一種常見的、高發(fā)的惡性腫瘤，我國每年新增肝癌患者占全球新增的55%，對(duì)該病的診治形勢(shì)依然十分嚴(yán)峻[1]。目前首選治療為手術(shù)切除，但大部分肝癌患者伴有肝硬化，使手術(shù)切除量有一定的限制[2]。近年來，經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈內(nèi)栓塞(Transcatheter arterial embolization，TAE)介入治療逐漸成為主要方法之一，但術(shù)后遠(yuǎn)期療效仍不理想，復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率高[3]。基因治療領(lǐng)域的重要發(fā)現(xiàn)之一是小干擾核糖核酸(Smallinterfering ribonucleic acid,siRNA)，為肝癌的靶向治療提供了新的治療手段，為不能手術(shù)患者的提供了新的途徑[4]。siRNA能特異地結(jié)合細(xì)胞內(nèi)靶mRNA形成沉默復(fù)合體，進(jìn)而阻斷或減少下游蛋白質(zhì)的合成，此為RNA干擾現(xiàn)象。siRNA誘導(dǎo)的基因沉默特異性高、操作簡(jiǎn)單、周期短，應(yīng)用前景廣闊[5]。經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈內(nèi)栓塞能加重缺氧微環(huán)境，升高肝癌細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)的基因表達(dá)，繼而引起血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的異常高表達(dá)，刺激腫瘤細(xì)胞的增殖[6-7]。本研究通過建立VX2肝癌兔模型，考察TAE聯(lián)合siRNA干擾HIF-1α對(duì)肝癌兔的療效及對(duì)HIF-1α、VEGF表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 儀器與試劑：HIF-1α多克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，HIF-1α shRNA購自美國Santa Cruz公司，大規(guī)模質(zhì)粒抽提試劑盒購自Qiagen公司，質(zhì)粒小量中提試劑盒購自北京天根生化，注射用青霉素鈉購自華北制藥，血管鞘、Cobra導(dǎo)管等購自Terumo；聚乙烯醇(PVA)微粒購自Cook公司，光學(xué)顯微鏡(OlympusBX53)購自O(shè)lympus，Philips Brilliance 64層螺旋CT購自荷蘭飛利浦公司，自動(dòng)生化分析儀(BA-200FR)購自日本東芝公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：以20只2～3個(gè)月齡的雄性新西蘭大白兔為研究對(duì)象，體重2.0～2.5 kg，由杭州余杭科聯(lián)兔業(yè)有限公司提供，許可證號(hào)SCXK(浙)2017-0004，合格證號(hào)1805160014。試驗(yàn)前進(jìn)行6 d的適應(yīng)性單籠飼養(yǎng)，溫度20～25 ℃，濕度40%～70%。荷瘤種兔1只，VX2由日本Funbanski公司引進(jìn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立：VX2瘤株從荷瘤兔中獲得，將生長完好的實(shí)性部分裁剪成1 mm3(長×寬×高為1 mm×1 mm×1 mm)的組織塊，放置備用。將實(shí)驗(yàn)兔麻醉、開腹及暴露肝臟后，在肝左葉部位植入剪好的腫瘤組織塊，用明膠海綿壓迫止血，回納肝臟于腹腔中，逐層縫合實(shí)驗(yàn)兔腹壁肌肉、皮膚。術(shù)后需保溫處理，直到實(shí)驗(yàn)兔蘇醒，蘇醒后放置在籠中，獨(dú)立飼養(yǎng)，每日肌肉注射1萬U/kg青霉素，維持3 d，術(shù)后兩周所有實(shí)驗(yàn)兔全麻下，行MRI 檢查，納入研究標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤最大徑<3 cm，且壞死灶<瘤體直徑1/2者，位于肝實(shí)質(zhì)內(nèi)，信號(hào)均勻。研究中造模兔無脫失，全部納入結(jié)果分析。

1.2.2 HIF-1α-shRNA的合成：第一步構(gòu)建HIF-1α-shRNA病毒載體，第二步提取質(zhì)粒，以shHIF-1α質(zhì)粒對(duì)293A細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，獲得腺病毒。以腺病毒對(duì)原代兔皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行感染，于48 h后檢測(cè)HIF-1α mRNA的表達(dá)，對(duì)shRNA進(jìn)行篩選，以HIF-1α基因敲降效率最高的作為目標(biāo)HIF-1α-shRNA。

1.2.3 治療方法：采用隨機(jī)數(shù)字表法將所有肝癌模型兔分為兩組，每組10只，所有實(shí)驗(yàn)兔均采用1%戊巴比妥鈉(3 ml/kg)耳緣靜脈麻醉，進(jìn)行股動(dòng)脈穿刺，穿刺成功后導(dǎo)入4F血管鞘，將4F Cobra導(dǎo)管插入腹腔干，以0.5 ml/s流率手推3 ml的對(duì)比劑 Omnipaque 350，以進(jìn)行腹主動(dòng)脈造影，再將2.7F同軸微導(dǎo)管置入肝左動(dòng)脈內(nèi)，DSA造影確認(rèn)移植瘤由肝左動(dòng)脈供血。兩組動(dòng)物在DSA透視導(dǎo)向下，對(duì)照組將PVA微粒與對(duì)比劑混懸液緩緩注入肝左動(dòng)脈，至腫瘤供血?jiǎng)用}血流完全停滯；研究組注入PVA微粒與對(duì)比劑混懸液及含有慢病毒顆粒的轉(zhuǎn)染溶液 (含HIF-1α shRNA)，注入量為0.6 nmol/L。

1.3 觀察指標(biāo) ①腫瘤體積：分別于術(shù)前1 d和術(shù)后28 d，采用螺旋CT進(jìn)行掃描，測(cè)量各組實(shí)驗(yàn)兔腫瘤體積。②肝癌組織核分裂象總數(shù)：于治療后28 d，處死實(shí)驗(yàn)兔，進(jìn)行病理學(xué)以及免疫組織化學(xué)檢查。于100倍鏡下計(jì)算腫瘤區(qū)域核分裂象總數(shù)。③HIF-1α 蛋白和VEGF蛋白的表達(dá)：采用免疫組織化學(xué)法，測(cè)定腫瘤組織HIF-1α 蛋白、VEGF蛋白的表達(dá)情況。④門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和丙氨酸基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平：分別于術(shù)前1 d和術(shù)后28 d，采集兩組耳緣靜脈血，以自動(dòng)生化分析儀測(cè)量兩組血漿AST、ALT水平。

2 結(jié) 果

2.1 兩組肝癌模型兔腫瘤體積變化 見表1。治療前兩組腫瘤體積比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；治療后兩組腫瘤體積均有一定程度的增加，與治療前比較，對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，研究組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；組間比較，研究組治療后腫瘤體積顯著降低(P<0.01)。

表1 兩組肝癌模型兔腫瘤體積變化(mm3)

2.2 兩組核分裂象總數(shù)比較 見表2。 研究組核分裂象總數(shù)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

表2 兩組核分裂象總數(shù)比較(個(gè))

2.3 兩組HIF-1α蛋白和VEGF蛋白表達(dá)比較 見表3。研究組腫瘤組織HIF-1α表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，研究組腫瘤組織VEGF表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。

表3 兩組HIF-1α蛋白和VEGF蛋白表達(dá)比較(pg/ml)

2.4 兩組血漿AST和ALT比較 見表4。治療前兩組ALT和AST水平比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05；治療后兩組ALT、AST水平均高于治療前(均P<0.01)；與對(duì)照組相比，研究組治療后ALT和AST水平均顯著降低(均P<0.01)。

表4 兩組血漿AST和ALT比較(U/L)

3 討 論

原發(fā)性肝癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在亞洲地區(qū)和非洲部分地區(qū)發(fā)病率高，患者年齡大部分在40～50歲，我國每年新增肝癌患者以及肝癌死亡人數(shù)居全球首位，是我國第三的腫瘤死亡原因以及發(fā)病率第四高的惡性腫瘤，其發(fā)生常與人們的生活習(xí)慣的等有關(guān)，一直以來，如何對(duì)肝癌進(jìn)行有效的預(yù)防和治療都是研究熱點(diǎn)。手術(shù)為首選治療方式，但80%以上患者伴有肝硬化，使得肝切除量受到限制，同時(shí)，部分肝癌部位接近第一、第二、第三肝口，為手術(shù)治療造成很大困難，因此，臨床上能進(jìn)行手術(shù)切除的患者較少[8]。近年來，TAE逐漸成為治療肝癌的主要手段之一，但遠(yuǎn)期療效有限，可能與TAE治療后產(chǎn)生缺血缺氧、壞死，腫瘤組織逐漸對(duì)缺氧微環(huán)境產(chǎn)生適應(yīng)性有關(guān)[9-10]。

基因沉默是近年來基因治療領(lǐng)域的重要進(jìn)展，其作用機(jī)制包括位置效應(yīng)、轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平[11-12]。RNA干擾為一項(xiàng)新興的基因阻斷技術(shù)，是一種由雙鏈RNA分子所介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后引起基因靜默的過程，表現(xiàn)為雙鏈RNA分子在mRN A水平選擇性關(guān)閉相關(guān)基因的表達(dá)。在多種腫瘤的治療中有廣闊的發(fā)展前景，siRNA水平基因調(diào)控的結(jié)果為轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默，該途徑對(duì)靶基因特異度高，毒性小，不與染色體 DNA相互作用，且誘導(dǎo)靶細(xì)胞基因突變的風(fēng)險(xiǎn)較低[13-14]。本研究通過siRNA干擾沉默HIF-1α基因，以抑制TAE 治療后的腫瘤缺氧適應(yīng)，從而抑制腫瘤血管生成。結(jié)果顯示，治療前兩組腫瘤體積比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；治療后兩組腫瘤體積均有一定程度的增加，與治療前比較，對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；研究組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；組間比較研究組治療后腫瘤體積顯著降低。對(duì)兩組核分裂像總數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，研究組核分裂像總數(shù)顯著低于對(duì)照組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即TAE聯(lián)合siRNA干擾能有效的抑制肝癌兔腫瘤組織的生長。

HIF-1α在肝癌兔腫瘤組織的缺氧適應(yīng)中能調(diào)控VEGF、IL-6以及TNF-α等多種腫瘤因子的表達(dá)[15-16]。其中血管生成調(diào)控因子特異性和作用最強(qiáng)的是VEGF，其產(chǎn)生并分泌于腫瘤細(xì)胞，具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的分裂和生長作用，進(jìn)而誘導(dǎo)新生血管形成，且VEGF能上調(diào)BCL-2的表達(dá)，從而抑制腫瘤的凋亡，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長[17-18]。本研究對(duì)兩組HIF-1α蛋白和VEGF蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，研究組腫瘤組織HIF-1α表達(dá)量、VEGF表達(dá)量低于對(duì)照組。表明TAE聯(lián)合siRNA能顯著抑制缺氧后靶部位HIF-1α和VEGF的蛋白表達(dá)。其機(jī)制可能在于，TAE能閉塞腫瘤供血?jiǎng)用}，改變腫瘤部位血流動(dòng)力學(xué)，導(dǎo)致HIF-1α-shRNA慢病毒載體長時(shí)間停留于靶部位，提高了轉(zhuǎn)染效率；缺氧環(huán)境中HIF-1α呈高表達(dá)狀態(tài)，但HIF-1α-shRNA能抑制其表達(dá)，進(jìn)而抑制肝癌組織中新生血管的生成，使癌細(xì)胞處于持續(xù)缺氧、壞死和凋亡狀態(tài)，進(jìn)而提高TAE療效[19-20]。

藥物只要通過肝臟和腎臟進(jìn)行排泄，易在該部位聚集產(chǎn)生毒性，因此本研究對(duì)兩組治療前后兩組血漿AST和ALT水平進(jìn)行比較，結(jié)果顯示治療前兩組ALT和AST水平比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；治療后兩組ALT、AST水平均高于治療前；與對(duì)照組相比，研究組治療后ALT和AST水平均顯著降低。表明HIF-1α-shRNA在抑制腫瘤的生長的同時(shí)，未增加肝癌兔的肝腎毒性，而對(duì)照組的ALT和AST水平更高，說明可能腫瘤本身對(duì)于肝腎功能損害更嚴(yán)重。

綜上所述，TAE聯(lián)合siRNA干擾HIF-1α能通過降低HIF-1α和 VEGF蛋白表達(dá)量抑制肝癌兔腫瘤的生長。