基于網絡藥理學的葛根芩連湯治療腹瀉作用機制研究

董永麗，史海霞，王 敏，劉全喜

(1.中國中醫科學院望京醫院，北京 101002；2.北京市中西醫結合醫院，北京 100039)

腹瀉是由一種或多種病因引起的常見消化道疾病癥狀，可根據病程分為急性腹瀉和慢性腹瀉兩類，臨床多表現為排便次數增多，糞便量增加，便溏稀，大便可伴有黏液、膿血或未消化的食物[1-2]。西醫常用治療方式主要集中在使用相關抗生素、止瀉藥物、補液糾正水電解質和酸堿失衡的對癥和營養支持治療[2]。針對慢性腹瀉的治療，長期使用化學類藥物會加速腸道病原菌耐藥性的產生，不利于后期臨床獲益[3]。

中藥具有毒性低，不易產生耐藥性，其含有的多種天然有效活性成分可起到多靶點、多途徑、協同作用的優勢，使腹瀉治療相關中藥復方成為本領域的研究熱點[3]。腹瀉在中醫屬“泄瀉”范疇，又稱“下利”“飧泄”“注泄”等，可從外感、內傷分為多種不同證候類型，基本病機為脾胃受損、濕困脾土導致腸道功能失調[4-5]。葛根芩連湯出自《傷寒論》，外可解肌表之邪，內可清陽明之熱[6]。研究表明，葛根芩連湯在治療腹瀉方面有顯著療效，針對小兒輪狀病毒感染性腸炎，葛根芩連湯可顯著縮短小兒腹瀉、發熱及嘔吐時間[7-9]。對于急性胃腸炎，葛根芩連湯高于90%的有效率與單純使用西藥治療相比優勢明顯[10-11]。潰瘍性結腸炎患者在服用葛根芩連湯治療后，臨床癥狀緩解較快，血常規的白細胞及便常規的紅白細胞計數也在短時間內恢復至正常水平[12-14]。現代研究發現，葛根芩連湯的組成藥物含有的有效中藥成分包括異黃酮類、生物堿類、黃酮類、甘草酸等，之所以能夠快速有效的發揮止瀉作用可能與其多成分多靶點作用有關[15-17]。同時，葛根芩連湯中的葛根素和黃芩苷還具有良好的抗炎作用，能降低多種致炎因子的血清含量[18-19]，還能通過抑制乙酰膽堿所致的腸道過強蠕動達到止瀉的目的[20]。由此可見，葛根芩連湯在治療腹瀉中顯示的良好療效與中藥多成分多靶點協同發揮作用密不可分，因此，本研究借助網絡藥理學研究葛根芩連湯治療腹瀉的作用機制，為中醫藥治療臨床疾病提供新的理論依據。

1 資料與方法

1.1 葛根芩連湯中藥復方的有效化學成分及潛在靶點的確定 基于中藥系統藥理學數據庫分析平臺(Traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)分別確定“葛根”“黃芩”“黃連”“甘草”四個藥物的所有化學成分，定義藥物口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(Drug-likeness，DL)≥0.18，篩選活性較高的化學成分。通過Uniprot數據庫分別檢索各靶點人類基因的簡稱，明確葛根芩連湯潛在靶點。

1.2 腹瀉疾病相關靶點的查詢 以“Diarrhea”為關鍵詞依次檢索OMIM數據庫、GeneCards數據庫和DisGeNET疾病數據庫，獲取腹瀉目前確定的所有疾病靶蛋白。利用Venny2.1在線軟件刪除三個數據庫重復的疾病靶點，確定最終的疾病靶點。

1.3 葛根芩連湯-腹瀉共同作用靶點的確定及關系網絡的構建 使用在線繪圖軟件Venny 2.1整合藥物與疾病的共同靶點，確定葛根芩連湯與腹瀉的共同靶點，繪制韋恩圖。利用Cytoscape 3.7.1繪圖軟件構建藥物成分-靶點-疾病網絡圖，使葛根芩連湯作用于腹瀉的靶點關系可視化。

1.4 蛋白互作網絡的構建 將葛根芩連湯與腹瀉的共同靶點導入STRING 11.0在線軟件，設置蛋白種類為“homo sapiens”，獲得蛋白互作信息圖。根據蛋白作用關系調整置信度蛋白質參數，初步設置參數為>0.7，確保研究數據的可靠性。

1.5 基因本體功能富集分析與京都基因與基因組百科全書通路富集分析 基因本體(Gene ontology，GO) 是基因本體論聯合會建立的一個數據庫，旨在建立一個適用于各種物種的、對基因和蛋白功能進行限定和描述的語義詞匯標準。GO注釋分為三大類，分別是：分子生物學功能(Molecular function，MF)、生物學過程(Biological process，BP)和細胞學組分(Cellular components，CC)。通過Metascape基因注釋軟件，對與腹瀉相關的葛根芩連湯藥對“活性成分-潛在靶點”網絡中的蛋白進行GO功能富集分析。京都基因與基因組百科全書 (Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG) 是一個整合了基因組、化學和系統功能信息的綜合數據庫。KEGG分析目的在于對探討治療腹瀉的生物學過程及關鍵信號通路。通過Cytoscape 3.7.1軟件中的“Clue GO”插件對關鍵靶點進行KEGG信號通路分析，獲得顯著富集的信號通路(P<0.05)。

2 結 果

2.1 葛根芩連湯化學成分及潛在靶點的確定 通過TCMSP數據庫初步檢索到已知的葛根芩連湯有效活性成分489個，其中符合條件的化學成分共146個，刪除重復的后共剩余121個，按照類藥性的大小依次降序排列排名前20的生物活性成分，見表1。

2.2 葛根芩連湯與腹瀉疾病共同靶點的預測 將以上121種生物活性成分使用TCMSP靶點預測指令進行靶點預測。其中葛根47個，黃芩85個，黃連158個，甘草199個，去除重復共獲得221個靶蛋白。經OMIM數據庫、GeneCards數據庫、DisGeNET查詢腹瀉相關靶點共5555個，查重后獲得5217個靶點。通過Venny取交集得到葛根芩連湯中參與腹瀉的靶點182個(圖1)。

表1 葛根芩連湯部分生物活性成分(前20名)

2.3 藥物-疾病共同靶點確定及網絡構建 將獲得的共同靶利用Cytoscape 3.7.1網絡繪圖軟件繪制并分析葛根芩連湯干預腹瀉成分-靶點網絡圖。紅色多邊形表示疾病，黃色箭頭代表葛根芩連湯活性成分，綠色橢圓表示各成分基因靶點，藍色菱形表示葛根芩連湯的藥物組成，作用關系分別用藍色、黃色、紅色線條連接。該網絡包括節點289個，靶點間共存在3500條相互作用線(圖2)。

圖1 藥物預測靶點與疾病靶點韋恩圖

2.4 葛根芩連湯腹瀉靶點PPI網絡構建及聚類分析 通過STRING 11.0數據庫在線檢索蛋白質(已知蛋白和預測蛋白)之間相互作用的數據庫，初步構建葛根芩連湯治療腹瀉的PPI網絡圖形，在Export模塊中，導出PNG格式的蛋白互作網絡關系圖，文本文件保存為TSV。將STRING 11.0構建的蛋白互作網絡圖導入Cytoscape軟件的MCODE插件利用網絡聚類算法，對相應的功能模塊進行美化調整，直觀的反應葛根芩連湯干預腹瀉的作用機制。其中利用STRING 11.0構建的蛋白網絡共包括：該網絡圖中包含182個，1388條關系線條，預期邊緣356個，PPI濃縮p<1.0e-16，進一步聚類分析預測出葛根芩連湯中的AKT1、CASP3、JUN、PTGS2、RELA、ESR1可能為治療腹瀉的核心關鍵蛋白(圖3)。

圖2 藥物-化合物-靶點-疾病靶點網絡圖

圖3 核心蛋白柱狀圖

2.5 生物通路富集分析 GO富集分析顯示(圖4),生物過程確定了157個GO條目，主要包括生物調節(Biological regulation)、細胞代謝(Neurotransmitter metabolism)、蛋白質結合(Protein binding)、離子結合(Ion binding)、信號受體結合(Signaling receptor binding)。

KEGG 信號通路分析結果(圖5),共確定167條信號通路，通路圖像中的富集程度用顏色深淺來表示，顏色越深說明富集程度越好，不同顏色節點表示不同通路。葛根芩連湯治療腹瀉的核心靶點主要通過IL-17信號通路、TNF信號通路、HIF-1信號通路、內分泌抵抗、Th17細胞分化、細胞凋亡與衰老信號通路作用于疾病。

圖4 葛根芩連湯藥對干預腹瀉GO分析柱狀圖

圖5 葛根芩連湯藥對干預腹瀉KEGG分析柱狀圖

3 討 論

腹瀉是消化系統疾病最常見的疾病之一，腹瀉的影響因素眾多，西醫治法以對癥治療為主，治療方案局限，尤其是針對長期反復發作的慢性腹瀉，單一西藥無法取得滿意的臨床療效[21]。葛根芩連湯是中醫臨床治療急慢性腸炎、細菌性痢疾等具有腹瀉癥狀的胃腸疾病的經方，尤善于祛除濕熱濁邪[22]。本方以性甘涼，歸胃經的葛根為君藥，升發脾胃清陽之氣，促進腸道運動排泄糟粕；以黃連、黃芩為臣藥，取二者苦寒之性起到燥濕止瀉的目的，又可兼顧調暢肝膽氣機，使濕熱之邪不易壅滯；以甘緩和中的甘草為佐使藥調和諸藥藥性，四藥共奏外疏內清之功[23]。葛根芩連湯以其精妙的組方及明確的療效，廣泛應用于臨床，但其作用機制尚未完全明確，網絡藥理學是一種能夠為中醫學從基于經驗的醫學邁向基于證據的醫學提供新的途徑的強大工具[24-25]。通過網絡藥理學分析，構建中藥與疾病的網絡關系，挖掘葛根芩連湯中的復雜成分之間的聯系，從現代醫學的角度為葛根芩連湯的組方及療效作用進行了新的科學解析。

葛根芩連湯首載于《傷寒論》：“太陽病，桂枝證，醫反下之，利遂不止，脈促者，表未解也；喘而汗出者，葛根黃芩黃連湯主之”。本方有解表清里之功，主治身熱下利，胸脘煩熱，口中作渴，喘而汗出的病證，為太陽、陽明經藥。君藥葛根的主要化學成分包括異黃酮類、香豆素類、生物堿類、芳香類等類別有效成分，具有增加血流量、改善微循環、緩解肌肉緊張、增強免疫力、減輕發熱、抑制炎癥反應的作用[26-27]。黃芩、黃連中藥物主要化學成分為黃芩素類、漢黃芩苷、黃芩黃酮、木蝴蝶素、生物堿、木脂素、香豆素、萜類、甾體、有機酸、揮發油、多糖等[28]。通過TCMSP篩選發現葛根芩連湯主要通過芒柄花黃素(Formononetin)、β-谷甾醇(Beta-sitosterol)、3’-甲氧基大豆素(3’-methoxydaidzein)、大豆甙元-4’，7-二葡萄糖甙(Daidzein-4’，7-diglucoside)的AKT1、CASP3、JUN、PTGS2等核心靶點的IL-17信號通路、TNF信號通路、HIF-1信號通路、內分泌抵抗、Th17細胞分化、細胞凋亡與衰老信號通路等通路作用于腹瀉相關疾病。

通過構建葛根芩連湯“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖，得出葛根芩連湯的有效成分121個，基因靶點221個，其中作用于腹瀉的潛在基因為182個，占全部靶點的80%以上，驗證了葛根芩連湯中藥復方的臨床有效性。脾主運化，胃主儲藏腐熟水谷，小腸主分清別濁，大腸主傳導，臟腑協調則氣機條達。葛根走脾、胃二經，黃芩、黃連苦寒，主清利腸道，甘草甘緩止痛，有降低腸道蠕動，抑制機體炎性反應，修復、重建損傷的腸道平衡的功效[29]。現代藥理研究認為，葛根芩連湯的抗病毒、抗菌、增強免疫力的作用，能夠明顯縮短濕熱型急性感染性腹瀉的病程，避免抗生素使用不當而繼發菌群失調[30]。葛根芩連湯治療腹瀉的核心靶點主要包括AKT1、CASP3、JUN、PTGS2、RELA、ESR1等靶點基因，通過GO富集分析發現主要參與DNA、RNA的轉錄，聚合酶Ⅱ特異性，細胞因子受體結合，酶與輔酶的結合，酰胺結合過程。說明葛根芩連湯對于腹瀉的治療作用主要是通過抑制炎性基因的酶活性，調控炎癥基因的轉錄，完成細胞修復與再生，從分子層面上消除腹瀉相關癥狀，符合中醫治病求本的辨證診療思路。

KEGG信號通路分析發現，葛根芩連湯作用通路主要分為病毒感染相關通路、細菌感染與修復相關通路、癌癥相關通路以及細胞再生與修復通路。其中，Salmonella infection、Shigellosis和Pathogenic Escherichia coli infection信號通路均為常見的細菌性痢疾通路，分別為沙門桿菌、志賀氏菌、致病性大腸桿菌作用通路，其中葛根芩連湯的潛在三者的作用靶點均在20個以上，主要通過抗炎免疫、抑制腸道平滑肌收縮，緩解腹瀉、腹痛的癥狀；PI3K-Akt信號通路可能通過降低腸道組織黏膜水腫和微血管通透性，誘導TNF-α、IL-1β和IL-6的表達，抑制細胞凋亡，對脂多糖誘導的急性胃腸炎癥具有保護作用[31]。IL-17信號通路屬于炎癥介導通路，主要通過活化T細胞、刺激Th17的分泌，加快成纖維細胞、IL-6等細胞因子產生炎癥反應，引起腸道內環境的破壞[32]。TNF、Apoptosis和Cellular senescence信號通路與機體內細胞因子分泌、細胞代謝、細胞凋亡密切相關，發生病變的胃腸道黏膜通過釋放TNFα等細胞因子，活化巨噬細胞，促使的細胞毒作用的發生，最終導致細胞的凋亡[33-34]。其他相關性較高的信號通路，目前尚未發現相關文獻報道，需要進一步探索，以證實其作用機制。

對于腹瀉的治療應堅持中西并用，傳承創新，充分發揮中西醫結合的優勢，最大利用中藥復方多靶點，多功效的特點。葛根芩連湯治療腹瀉的靶點復雜，通路多樣，本研究借助網絡藥理學初步明確了葛根芩連湯的抗炎免疫機制，主要起到抗炎、緩解肌肉痙攣的作用，具體分子機制尚未驗證，后期完善需要借助分子對接及分子生物學研究，完善葛根芩連湯的作用機制，明確葛根芩連湯治療腹瀉的核心通路。