基于COXⅠ及ITS基因糞類圓線蟲(chóng)PCR鑒定方法的建立

蘆亞君，邢維媚，夏乾峰

（海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，海南 海口 571199）

糞類圓線蟲(chóng)（Strongyloides stercoralis）是一種土源性蠕蟲(chóng)，流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)[1,2]。目前，糞類圓線蟲(chóng)病常用的診斷方法是在患者糞便中檢出桿狀蚴、絲狀蚴或蟲(chóng)卵。在光學(xué)顯微鏡下檢獲蟲(chóng)體的病原學(xué)診斷方法雖然簡(jiǎn)便快捷,但敏感性和特異性低。糞類圓線蟲(chóng)的蟲(chóng)卵和幼蟲(chóng)均與鉤蟲(chóng)、東方毛圓線蟲(chóng)在形態(tài)上區(qū)別不明顯，易混淆[3]。

本研究擬用COXⅠ基因和ITS 基因作為分子標(biāo)記對(duì)糞類圓線蟲(chóng)進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定[4]，以明確診斷。以糞類圓線蟲(chóng)病患者的糞便作為檢驗(yàn)物純化糞類圓線蟲(chóng)蟲(chóng)體,提取蟲(chóng)體 DNA，PCR 擴(kuò)增COXⅠ和ITS 基因，探討分子鑒定在糞類圓線蟲(chóng)病診斷的應(yīng)用,為臨床上確診糞類圓線蟲(chóng)感染提供明確的分子生物學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蟲(chóng)體來(lái)源 2018 年5 月海南省某醫(yī)院糞類圓線蟲(chóng)病腹瀉患者的糞便。

1.2 試劑 動(dòng)物組織直接PCR 試劑盒購(gòu)于北京百泰克生物技術(shù)有限公司，2×TSINGKE Master Mix(blue)購(gòu)于北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司，DL20 00 DNA Marker 購(gòu)于北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司、核酸染料GelRed 購(gòu)于biosharp，引物由廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司合成。

1.3 儀器 高效組織細(xì)胞破碎儀購(gòu)于湖北新縱科病毒疾病工程技術(shù)有限公司,小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) Eppendorf 5424R、MASTERCYCLER PRO PC R 儀購(gòu)于 eppendorf（中國(guó)）有限公司；L1 型低溫連接儀購(gòu)于珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司,全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)Tanon-1600 購(gòu)于上海天能科技有限公司。

1.4 形態(tài)學(xué)鑒別 使用生理鹽水直接涂片法檢查該腹瀉患者糞便，結(jié)合病史及臨床癥狀，在光學(xué)顯微鏡下初步鑒定蟲(chóng)種蟲(chóng)期。

1.5 蟲(chóng)體前處理 取患者糞便分裝于1.5ml 無(wú)菌研磨管內(nèi)，生理鹽水重懸糞便，12000rpm 離心5min，棄上清，重復(fù) 3 次[5]。向沉淀加入 100μl AB 溶液和研磨珠置于研磨儀中5000rpm 研磨30s,重復(fù)5 次,加入 25μl AD Buffer，室溫放置 10min 后，95℃孵育5min,加入100μl AC 溶液后即為蟲(chóng)體粗提物。

1.6 COXⅠ基因PCR 反應(yīng) 擴(kuò)增COXⅠ基因的上游引物 ST COI NF：5’-GGTTTATGGGCTGGTATGA-TTG-3’，下游引物 ST COI NR: 5’-AAACCTTAACACCAGTAGGGAC-3’。PCR 體系總體積為20μl：2×PCR Mix 10μl,上游引物、下游引物各 0.8 μl，蟲(chóng)體粗提物 4μl，ddH2O 4.4μl。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù) 變性 3min，94℃變 性 1min，48℃退 火1min，72℃延伸 2min,35 個(gè)循環(huán),72℃后延伸 10min，反應(yīng)設(shè)置2 個(gè)平行。

1.7 ITS 基因PCR 反應(yīng) 擴(kuò)增ITS 基因的上游引物NC5：5’ -GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT -3’,下游引物 NC2：5’-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3’[6]。PCR 體系總體積為 50μl：2×Master Mix 25 μl，上游引物、下游引物各 1μl，蟲(chóng)體粗提物 1μl，ddH2O 22μl。梯度 PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5min；94℃變性 30s, 退火溫度分別設(shè)置為 45℃、50℃、55℃、60℃退火 30s，72℃延伸 1min，35 個(gè)循環(huán)；72℃后延伸5min，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置2 個(gè)平行。

1.8 電泳 PCR 反應(yīng)結(jié)束后，取 5μl 擴(kuò)增產(chǎn)物于120V 電壓下進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 光鏡下觀察糞便中的蟲(chóng)體為糞類圓線蟲(chóng)桿狀蚴蟲(chóng)期，蟲(chóng)體無(wú)色透明、光滑、線狀，具有折光性，前端鈍圓，尾端尖細(xì)，見(jiàn)圖1。

圖1 糞類圓線蟲(chóng)桿狀蚴

2.2 電泳 COXⅠ基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外成像系統(tǒng)下觀察具有特異性條帶，大小約1500bp，見(jiàn)圖2。

圖2 COXⅠ基因1%瓊脂糖凝膠電泳

ITS 基因 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在退火溫度 45℃、50℃、55℃時(shí)有明顯的特異性條帶，其中50℃目的條帶最亮，目的條帶大小在900bp 之間。而退火溫度是60℃時(shí)無(wú)目的條帶，見(jiàn)圖3。

2.3 序列分析 Genebank 中檢索顯示不同線蟲(chóng)的COXⅠ基因均在1500~1700bp 之間，見(jiàn)表1，而ITS基因在不同線蟲(chóng)中的堿基組成中顯示，其分別包括18S、5.8S 和28S 的部分或完全序列，因此堿基長(zhǎng)度變化較大，見(jiàn)表2。

3 討論

圖3 ITS基因1%瓊脂糖凝膠電泳

表1 不同線蟲(chóng)COXⅠ基因比較

表2 不同線蟲(chóng)ITS基因比較

糞類圓線蟲(chóng)既可以在溫暖潮濕的疏松土壤中營(yíng)自生生活，也可以在宿主體內(nèi)營(yíng)寄生生活，是一種致病性兼性寄生蟲(chóng)[7]。糞類圓線蟲(chóng)感染期幼蟲(chóng)絲狀蚴經(jīng)皮膚或口腔黏膜侵入人體后，進(jìn)入靜脈，經(jīng)過(guò)右心進(jìn)入肺，在肺泡內(nèi)短暫逗留后沿氣管、支氣管逆行至咽部，隨人的吞咽行為到達(dá)胃、小腸，或在體內(nèi)移行至腸外器官。對(duì)于免疫力低下者或者患有惡性腫瘤、長(zhǎng)期使用免疫抑制劑、激素等感染者[8,9]，本蟲(chóng)易在體內(nèi)進(jìn)行播散性傳播或自體感染。蟲(chóng)體若侵犯顱腦、睪丸、腹股溝等部位[10-12]，臨床癥狀不典型、糞便檢出率極低、易造成誤診和漏診,嚴(yán)重患者易致死。據(jù)報(bào)道，福建、浙江等地均已發(fā)現(xiàn)糞類圓線蟲(chóng)致死病例[13,14]。傳統(tǒng)的糞類圓線蟲(chóng)病的診斷方法是依靠檢驗(yàn)物中檢獲出蟲(chóng)體,生理鹽水直接涂片法鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察加以判斷。其局限性在于糞量的多少、糞便性狀、涂片的厚薄及蟲(chóng)體的完整性。另外，鉤蟲(chóng)、東方毛圓線蟲(chóng)等線蟲(chóng)與糞類圓線蟲(chóng)具有相似的形態(tài)學(xué)特征，難以區(qū)別，對(duì)于確定蟲(chóng)種還需要具有豐富經(jīng)驗(yàn)的操作人員[15,16]。相比于形態(tài)學(xué)鑒定法，以糞類圓線蟲(chóng)特異性序列的PCR 技術(shù)可提供快速準(zhǔn)確的分子診斷依據(jù)[17]。

COXⅠ基因是常用的分子遺傳標(biāo)記，廣泛應(yīng)用于物種的鑒定和分類。本研究經(jīng)PCR 擴(kuò)增電泳后結(jié)果顯示，COX I 基因的目的條帶約為1500bp，大小符合Genebank 中檢索到的其他線蟲(chóng)。ITS 基因擴(kuò)增使用梯度PCR 方法, 探討了不同退火溫度對(duì)產(chǎn)物的影響，發(fā)現(xiàn)50℃時(shí)目的條帶最明顯，為最佳退火溫度，而60℃無(wú)目的條帶，說(shuō)明不同退火溫度對(duì)ITS 基因的擴(kuò)增效果存在差別。在Genebank 中檢索到不同線蟲(chóng)的ITS 序列，分別包含部分或完全的 18s rRNA、ITS1、5.8s rRNA、ITS2、28s rRNA 基因，因此堿基長(zhǎng)度范圍較大。但本實(shí)驗(yàn)使用ITS 的上、下游引物擴(kuò)增，其產(chǎn)物由ITS1、5.8s rRNA、ITS2組成，長(zhǎng)度約為900bp，符合Genebank 中檢索到的序列范圍。

本研究探討了基于COXⅠ及ITS 基因的糞類圓線蟲(chóng)PCR 診斷技術(shù)的建立, 并對(duì)反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化探討,為糞類圓線蟲(chóng)病準(zhǔn)確及時(shí)的臨床診斷提供了技術(shù)支持，也為該蟲(chóng)的分子分類、基因多態(tài)性研究奠定了基礎(chǔ)[18]。