高通量測序技術在循環腫瘤DNA檢測中的應用

李斯特，徐文博

（思路迪醫學檢驗所有限公司）

腫瘤已成為人生命健康的重要威脅因素，我國每年新發癌癥病例約392.9 萬例，癌癥死亡約233.8 萬例，發病率接近世界平均水平，死亡率更是高于世界平均水平[1]。腫瘤發生是一個漸進的過程，基因突變通常發生在腫瘤發生過程中，可用于腫瘤診療。現有腫瘤基因診斷方法主要基于組織活檢以及液體活檢，組織活檢通常存在組織異質性、腫瘤內異質性、轉移間異質性和時間異質性，存在一定的局限性，可能導致錯失針對性治療機會或治療干預不當。對比傳統組織活檢，液體活檢具有非侵入性、患者依從性高、取樣量少、取樣風險低、特異性高、可重復多次取樣等優點，并且可解決腫瘤異質性的問題，在腫瘤的早期輔助診斷、伴隨診斷、治療監測、預后評估等方面的應用價值極高，液體活檢可能是未來幾年腫瘤最具影響力的領域之一[2,3]。

液體活檢檢測的樣本主要包括循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)、循環腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)和外泌體等，其中 ctDNA是目前臨床實驗室應用最多的液體活檢靶標。盡管近年來ctDNA 的研究取得了大量的成果，但ctDNA 作為生物標志物在臨床應用中仍存在許多技術問題。這主要是因為與正常體細胞DNA 相比，ctDNA 具有以下獨特的特征:(1)它處于動態、實時變化的狀態，ctDNA 含量隨腫瘤分期的變化而動態變化;(2)半衰期短，通常為2h[4];(3)DNA 片段破碎程度高，在酶切的作用下，長度主要在166 bp 左右[5]；(4)與大量野生型DNA 共存，血液中突變型ctDNA 的拷貝數僅為野生型的1%或更少，野生型DNA 中僅一個堿基差異即可嚴重干擾突變型ctDNA 的檢測[6];(5)濃度低,每毫升血漿樣本中只有幾十個ctDNA 拷貝。這些特征使得ctDNA 的檢測比體細胞更難。因此，檢測ctDNA 的技術平臺需要具有高度的特異性和靈敏度。

1 NGS技術是檢測ctDNA的核心技術

ctDNA 是一類來源于腫瘤細胞的循環游離DNA (cfDNA),由腫瘤細胞凋亡、壞死或分泌產生的DNA 片段[7,8]。一般來說,ctDNA 包含與產生 ctDNA的腫瘤DNA 相同的基因缺陷,如突變、缺失、插入、重排、 拷貝數異常以及甲基化等相關突變信息。ctDNA 在腫瘤細胞凋亡或壞死后進入循環系統時，保留了相對完整的遺傳信息。腫瘤細胞中的大部分DNA 突變都可以在ctDNA 中得到反映，通過檢測ctDNA，可以獲得大量的腫瘤信息。檢測結果可用于判斷腫瘤突變類型、腫瘤分期、復發轉移的可能性。

目前,實驗室常用的ctDNA 檢測方法目前主要分為靶向檢測和非靶向檢測，靶向檢測的目的是識別一個或幾個常見靶向治療相關基因的已知突變，檢測技術為基于聚合酶鏈式反應（PCR）技術，包括熒光定量PCR、數字PCR(digital PCR，dPCR)和核酸質譜檢測等； 非靶向檢測的目的則是同時識別多基因,包括腫瘤治療相關的已知突變及未知突變，檢測技術以高通量測序(next generation se-quencing，NGS)為主，隨著 NGS 技術的高速發展，其通量高、敏感度高及對DNA 樣本濃度要求低等優點，已成為液體活檢實驗室檢測的核心技術。

2 NGS技術檢測ctDNA技術的選擇

NGS 技術能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA 分子進行序列測定，具有高通量和高自動化程度，可以在短時間內完成數千億堿基的測序，對比一代測序（Sanger 測序），NGS 對 DNA 模板的濃度和純度要求更低，通過對同一區域的DNA 片段進行重復測序，可實現高深度測序，因而獲得了更高的靈敏度、特異性和準確性，也正是由于NGS 技術的技術優勢，使得NGS 技術非常適合樣本濃度低、高度片段化的ctDNA 檢測。盡管NGS 具有較高的靈敏度和特異性，但根據應用平臺的不同，其隨機錯誤率在0.1%至1%之間[9]，這使得通過總cf DNA 中的罕見突變檢測ctDNA 具有挑戰性。因此NGS 在ctDNA 的檢測中衍生了多個應用技術，包括全基因組測序(whole-genome sequencing, WGS)、全外顯子組測序（whole-exome sequencing, WES）、深 度 測 序 、TAm-Seq （tagged-amplicon deep sequencing，標記擴增深度測序）、 Safe-SeqS（safe-sequencing system，安全測序系統)和CAPP-Seq(Cancer Personalized Profiling by Deep Sequencing，深度測序腫瘤個體化建檔法)等。

2.1 全基因組測序 （WGS） 全基因組測序是對生物全基因組序列進行測序，以獲得完整的基因組信息,可檢測的突變類型包括點突變、Indel、重排和CNV。ctDNA 在轉移性癌癥中具有很高的敏感性和特異性[10]。但是，ctDNA 測定都依賴于復發基因中的特定突變或需要對腫瘤組織進行測序,這無疑給轉移性癌癥的預后檢測帶來了阻礙。Aguilar-Mahecha A 等[11]通過低深度全基因組測序技術(lowpass whole genome sequencing, low-pass WGS)對轉移性乳腺癌患者的ctDNA 進行檢測，將患者DNA的拷貝數變化用于計算基因組不穩定性數(GIN)，該研究結果表明，基線、早期、治療時的GIN 值和動態變化可以預測治療的反應，以及總生存期。通過該方法既可以預測3 個月的早期腫瘤反應，也可以預測預后,為轉移性乳腺癌早期預測及預后提供了更可行的方法。

2.2 全外顯子組測序 （WES） 全外顯子組測序是一種廣泛使用的NGS 方法, 人類外顯子組所占基因組的比例不超過2%，但它包含了約85%已知與疾病相關的變異[12]，WES 和WGS 之間最大的區別是生成的數據的數量和內容。一般來說，如果目標是尋找目標突變，WES 更適合,并且成本會更低,這使得該方法成為全基因組測序的一種經濟高效的替代方法。在非小細胞肺癌的治療中,盡管免疫檢查點抑制劑(ICIs)延長了部分晚期非小細胞肺癌(N SCLC)患者的腫瘤反應,但大多數患者會出現繼發性耐藥,了解ICIs 的晚期進展機制對改進未來的預后治療策略很重要。Etienne Giroux Leprieur 等[13]對8 例非小細胞肺癌患者ctDNA 進行了全外顯子組測序(whole- exome sequencing, WES)，并比較了使用ICIs 治療的晚期NSCLC 患者在至少治療6個月后,初始和延長腫瘤應答并出現繼發進展的患者在ICI 治療開始和腫瘤進展之間的分子譜，首次發現了Wnt 通路在晚期NSCLC 繼發性耐藥中的作用, 對非小細胞肺癌的晚期治療提供了新的思路。

全基因組測序(WGS)或全外顯子組測序(WES)的優勢包括:(1)能夠識別腫瘤治療過程中發生的新變化，發現新的未知突變；(2)不需要關于原發腫瘤基因組的信息。在科研級的ctDNA 研究中有廣泛的使用，并且已經走進了“千元基因組”時代。然而對于臨床級的使用，無論是WGS 還是WES 都需要較高的樣品量，并且需要花費大量的設備、場地、人員資質、數據解讀等相關成本，這阻礙了它們在臨床用于篩查和早期診斷的推廣。

2.3 DNA 甲基化測序 ctDNA 的甲基化水平可用于腫瘤的診斷。目前美國食品藥品監督管理局（FDA）已批準血漿SEPT9 基因甲基化檢測，可作為結直腸癌的篩選試驗。CFDA 目前批準了SHOX2、 RASSF1A 基因甲基化檢測，通過肺泡灌洗術獲取可溶性滲出物, 用于早期肺癌的輔助診斷。但是已批準的ctDNA 突變或甲基化檢測，均基于熒光定量PCR 的方法，該方法的檢測靈敏度有限。近年來結合數字PCR、NGS 等方法，液體活檢的檢測靈敏度有大幅提升。其中測序方法的應用大大提高了檢測通量并能發現更多潛在的腫瘤變異。最近，基于cfDNA 全基因組測序發現，起源于腫瘤的ctDNA 存在片段圖譜的特征性改變，這為未知腫瘤的篩查監測提供了一種新的分析方法。腫瘤發生早期，DNA 已經出現了甲基化的趨勢或CpG 局部甲基化的改變，因此可以通過體液活檢檢測ctDNA 的水平和甲基化特征來實現腫瘤的早期診斷以及分期[14]。另外，DNA 甲基化異常則可提示腫瘤的侵襲性和手術切除后復發的風險。由于ctDNA 的半衰期較短（約 2h）術后 ctDNA 在血液中的持久性與較差的預后相關[15]。ctDNA 的甲基化測序后特征可以預測癌癥患者的術后復發及死亡風險，有助于調整治療方案，評估是否需要術后化療以及確定化療方案。

2.4 靶向測序 (targeted sequencing, TS) 為了利用NGS 更快速地檢測目的基因突變,并在保證檢測準確性和測序深度的基礎上降低成本，靶向測序(targeted sequencing, TS) 正受到越來越多的關注。與WGS 和WES 相比，TS 可以獲得更大的覆蓋范圍和更高的數據精度，提高目標區域的檢測效率。同時縮短了檢測周期，降低了測序成本，適合分析大量樣本。目前，通過TAm-Seq、CAPP-Seq 等方法進行癌癥個性化分析, 是ctDNA 靶向深度測序的主要技術。TAm-Seq 的檢出限為0.02%，對循環DNA中EGFR 點突變的特異性為99.9997%[16],保證了高特異性及高靈敏度;CAPP-Seq 在NSCLC 患者中檢測EGFR 突變也是高度敏感, 特異度＞99.99%[17,18],兩種方法是研究ctDNA 非常實用的測試方法，但是TAm-Seq 以及CAPP-Seq 均只能檢測已知突變，對于研究未知突變有一定的局限性。若通過對高覆蓋的靶區(＞10,000×)進行測序，其靈敏度可達到0.02%，特異性可達到80%[19]，有研究通過獨特分子標記(UMT)和下一代超深度測序檢測在早期或晚期乳腺癌患者中的ctDNA[20]，由于ctDNA 的含量非常低，因此以排除克隆造血(CH)來源的變異，該研究對于突變的患者，采用相應的白細胞(WBC)的DNA 進行對照測序，排除CH 突變后，局部或局部晚期乳腺癌(I-III 期)的ctDNA 檢出率為37%，轉移性或復發性乳腺癌的ctDNA 檢出率為81%，為乳腺癌的靶向治療提供了新的檢測方法，通過血漿ctDNA 和WBC 進行配對測序可以提高液體活檢的準確性。

3 NGS技術檢測ctDNA臨床應用

ctDNA 相關標志物在臨床應用的研究領域包括伴隨診斷指導用藥、治療監測、早期輔助診斷等多個方面。目前國內批準的ctDNA 基因突變檢測試劑的方法為ARMS-PCR 的方法，而基于NGS 技術檢測ctDNA 的試劑僅在美國FDA 有獲批，但是基于NGS 技術ctDNA 基因突變檢測的腫瘤早期輔助診斷，術后腫瘤復發監測、腫瘤治療后效果評估、微小殘留病灶診斷（MRD）等前沿性臨床應用的開發及研究成果層出不窮，為未來的臨床推廣帶來希望。

3.1 腫瘤早期篩查 腫瘤早期篩查 （簡稱癌癥早篩）是指借助于快速、簡便、有效的方法，從大量無癥狀的“健康”人群中篩選出腫瘤高危群體或者腫瘤陽性患者的過程。由于腫瘤的早期發現可以進行提前干預，明顯降低死亡率、延長生存期,因此腫瘤早篩具有非常重要的意義。近年來ctDNA 研究重心逐步前移到腫瘤超早期篩查上,有研究標明[21],接受手術和輔助治療的乳腺癌患者，對16 個與原發腫瘤相關的突變,在這些動態采集的血漿ctDNA樣本中進行超深NGS 測序。發現18 例復發患者中，高達16 例ctDNA 檢測結果早于常規影像學發現，31 例未復發患者任一時間點血漿樣均為ctDNA 陰性，特異性為100%。美國GRAIL 公司計劃2021 年推出的液體活檢產品Galleri 是一項基于cfDNA 靶向甲基化的血液檢測分析方法,該檢測可區分多階段的50 多種癌癥類型，包括缺乏篩查指南的高死亡率癌癥和早期癌癥, 可作為一種LDT檢測用于50 歲以上的無癥狀人群的癌癥篩查。

3.2 腫瘤微小病灶殘留檢測 微小殘留病灶（Minimal Residual Disease，MRD）,是癌癥治療后殘留在體內的少量對治療無反應或耐藥的癌細胞,傳統影像學或實驗室方法不能發現,但可通過液體活檢發現癌來源分子存在異常,代表腫瘤的持續存在和臨床進展可能。根據我國《肺癌MRD 的檢測和臨床應用共識》，肺癌分子異常指的是外周血可穩定檢出豐度≥0.02%的ctDNA，包括肺癌驅動基因或其他的I/II 類基因變異。MRD 檢測技術包括RTPCR、流式細胞術、數字微滴PCR 和NGS，目前處于探索階段，需要前瞻性研究確定其敏感性、特異性和預測價值。對于早期或晚期腫瘤患者進行MRD 檢測，可有助于判斷手術或治療后預后，和制定進一步的治療策略。目前一些研究進展表明MRD 可用于白血病、肺癌、結直腸癌和乳腺癌的預后和治療方案評估[22-28]。

目前國外一些商業化MRD 檢測開始應用到臨床。Natera 公司的Signatera 檢測產品獲得美國FDA“突破性設備”認定，能夠個體化設計16 種獨特的克隆性體細胞變體,隨后進行多重PCR(mPCR)和超深度測序（靶標平均＞100,000 個reads），用于全血樣品縱向ctDNA 分析并檢測微小殘留病變（MRD）。2021 年美國紐約州衛生部臨床實驗室評估項目 （CLEP） 批準了 Guardant Health 公司的Guardant Reveal 液體活檢產品用于檢測和監測早期癌癥患者（結直腸癌，CRC II 和III 期）的MRD,意味著紐約州的腫瘤科醫生可以使用Guardant Reveal 的MRD 檢測來識別可能受益于輔助治療的結直腸癌高風險患者和監測癌癥復發。

3.3 腫瘤伴隨診斷指導用藥 美國FDA 于2020 年8 月 7 日已批準 Guardant Health 基于 NGS 的液體活檢測定法，Guardant360 CDx，用于患有任何實體惡性腫瘤的晚期癌癥患者的腫瘤突變圖譜分析，同時還被批準為一種輔助診斷方法，用于識別表皮生長因子受體（EGFR）基因突變的轉移性非小細胞肺癌（NSCLC）患者，這些患者可能會受益于奧西替尼的治療。這是FDA 批準的首個將NGS 和液體活檢技術結合，指導臨床治療決策的診斷檢測。2020 年美國FDA 批準了基于NGS 的液體活檢伴隨診斷大 panel 檢測產品 FoundationOne Liquid CDx 上市，該產品可檢測324 個基因的變異信息及免疫治療相關的生物標志物血液微衛星不穩定性（bMSI）和血液腫瘤突變負荷（bTMB），適用于泛實體瘤，并作為多個靶向藥物的伴隨診斷。

4 展望

隨著檢測技術的更新迭代,液體活檢技術也在飛速發展中, 雖然ctDNA 是目前液體活檢技術中使用最多的標志物,但是我們也看到在實際檢測中依然存在著一些挑戰, 技術上對檢測靈敏度要求高、對測序深度要求高，臨床應用上還缺乏大量的臨床有效性證據。高通量測序具有的高靈敏度和高通量，已成為ctDNA 檢測的主流技術平臺，雖然在前沿性的科研中，NGS 技術能夠大放異彩，但在臨床應用中卻還在初級階段,一方面是由于臨床級測序價格高,需要開展單位擁有從平臺建設到人員資質全力投入, 另一方面由于NGS 技術發展速度快,開發符合政府監管的產品周期非常長，往往拿到注冊證時，檢測的產品也有些過時了。因此NGS技術在ctDNA 檢測的發展應用中，是機會與挑戰并存的，需要不斷完善技術，加快臨床轉化，才能造福患者。