酶免試劑的灰區設置在無償獻血中應用的必要性探討

張燕，陳明軍，呂永磊，金新莉，方建華，李建斌

（河南省紅十字血液中心，河南 鄭州450000）

酶聯免疫吸附試驗（ELISA，enzyme-linked immunosorbent assay） 是國內血站篩查實驗室檢測HBsAg、抗-HCV、HIV 和抗-TP 的最常用的方法[1]。為了防止弱陽性標本漏檢,最大限度的確保血液安全,很多實驗室按照試劑說明書要求臨界值的0.5~0.9 倍設置自己實驗室的臨界值[2]，即所謂的“灰區”。我們實驗室也不例外，ELISA 檢測所用8 種試劑的臨界值定為0.7 倍cutoff，即檢測值(S/CO)大于或等于0.7 的標本判定為不合格。隨著血站系統檢測試劑靈敏度的不斷提高和核酸檢測的全覆蓋，ELISA 檢測“灰區”的存在是否還有必要，本文通過對ELISA 四項的血清盤進行檢測，分析灰區設置的必要性。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 乙肝表面抗原檢測試劑盒 (1--23081、2--23043) ，丙肝抗體檢測試劑盒 (1--23081、2--23001) ，人類免疫缺陷病毒抗體檢測試劑盒( 1--23081) ，人類免疫缺陷病毒抗原/抗體檢測試劑盒( 2--23089) ，梅毒螺旋體抗體檢測試劑盒( 1--23081、2--23043)。Microlab STAR 全自動樣本處理系統 ( 瑞士哈美頓) ，Microlab FAME 全自動酶免分析儀( 瑞士哈美頓)，Sunrise 酶標儀( 瑞士帝肯) 等。質控品為酶免四項混合質控，來源于北京康徹思坦生物有限公司。

1.2 血清盤的來源與構成 血清盤來源于國家衛健委臨檢中心，2017 年11 月份到12 月份，我們實驗室參加了衛健委臨檢中心組織的多中心評估活動，全國21 家血液中心和中心血站參與，包括7家發光系統和6 家酶免試劑，其中HBsAg 共有9個血清盤，共計792 個標本，包括423 個真陽性+質控76 個+特殊設計樣本97 個+不確定 8 個+真陰性 188 個；抗-HCV 共 8 個血清盤，共計 704 個標本，包括真陽性318 個+質控128 個+真陰性155個+103 個不確定；HIV 共 4 個血清盤，共計 330 個標本，包括149 個真陽性+質控76 個+5 個不確定+78 個真陰性標本；抗-TP 共7 個血清盤，共計616個標本，包括373 個真陽性+質控84 個+特殊樣本11 個+不確定 18 個+真陰性 130 個。

1.3 血清盤的判定規則 國家衛健委臨檢中心使用8 種ELISA 試劑和7 種化學發光試劑對血清盤結果進行確認，所有試劑結果均為反應性的標本判定為真陽性，反之則判定為真陰性。結果不一致時采用確證實驗，其中HBV 采用中和實驗（羅氏、雅培、索林）、核酸和“兩對半”；HCV 采用 RIBA 和核酸實驗；HIV 采用WB 和核酸實驗；TP 采用TPPA 和RIBA。確定實驗和核酸檢測均為反應性時判定為真陽性，反之則判定為真陰性，兩者結果不一致時判定為不確定。本文中納入統計結果的標本為真陽性和真陰性標本。

1.4 灰區設置 本實驗室所用8 種ELISA 試劑的灰區設置為0.7～1.0，即S/CO≥0.7 判定為有反應性；S/CO＜0.7 判定為無反應性。

1.5 統計方法 將檢測結果與最終判定結果比較，計算各試劑的檢測靈敏度 （檢測為真陽性數量/確證為真陽性數量×100%）、檢測特異性（檢測為真陰性數量/確證為真陰性數量×100%）、約登指數（為靈敏度+特異性）-1。統計工具采用2010 版EXCEL。

2 結果

2.1 兩種HBsAg ELISA 試劑結果分析 納入統計的HBV 標本共計611 例，見表1。從結果來看，兩種HBsAg ELISA 存在一定比例的假陰性標本。而我實驗室設置的臨界值0.7 和試劑說明書上臨界值為1，就靈敏度、特異性和約登指數來看，沒有明顯差異。

表1 兩種HBsAgELISA結果分析

2.2 兩種抗-HCV ELISA 試劑結果分析 納入統計的HCV 標本共計473 例，見表2。從結果來看，兩種抗-HCV ELISA 試劑的靈敏度與臨界值為0.7和1 時沒有明顯差異，但是兩種試劑的特異性在臨界值為1 時有顯著提高。

表2 兩種抗-HCVELISA結果分析

2.3 兩種HIV ELISA 試劑結果分析 納入統計的HIV 標本共計 227 例，見表3。從結果來看，進口試劑靈敏度為100%，而特異性在臨界值為1 時提高到92.3%； 國產試劑在靈敏度稍低于進口試劑，特異性在臨界值為1 時也有所提高。

表3 兩種HIVELISA結果分析

2.4 兩種抗-TP ELISA 試劑結果分析 納入統計的TP 標本共計 503 例，見表4。從結果來看，兩種ELISA 試劑的靈敏度都大于99%，但都存在一定比例的假陽性，不設置灰區時特異性有所提高。

表4 兩種抗-TPELISA結果分析

2.5 8 種ELISA 試劑最佳臨界值的確定 圖1 為7種國產ELISA 試劑的臨界值從0.05～1.2 時的約登指數，圖2 為 1 種進口ELISA 試劑的臨界值從0.4～1.2 時的約登指數。表5 為各試劑在最大約登指數下的靈敏度和特異性和S/CO。從結果來看，兩種HBsAg 試劑的最佳臨界值分別為0.3 和0.2，另外6 種ELISA 試劑的最佳臨界值為1～1.2。

3 討論

圖1 7 種國產ELISA試劑不同臨界點（S/CO值）下的約登指數

圖2 1 種進口ELISA試劑不同臨界點（S/CO值）下的約登指數

表5 各試劑最大約登指數下的S/CO值及其靈敏度和特異性

據文獻報道，不同的試劑盒其包被抗原的來源、純度、包被工藝及包被量等都存在差異，使得不同的試劑盒對不同片段的抗原或抗體的反應不同，同時加上不同方法學所受的干擾不同，從而出現不同的試劑盒對同一標本的測定結果有可能不同，導致實驗中不同的試劑篩查結果有差異[3]。

WHO 輸血傳播感染篩查策略明確指出血液檢測篩查方法應具有較高的靈敏度和足夠的特異性，避免由于非特異結果給獻血者帶來不必要的淘汰。灰區設置應本著必要及合理，不能過度的強調試劑靈敏度而忽略特異性，從而影響試驗的總體性能。再者，如今血液的采集和臨床供應短缺已成為常態化，血液資源更顯得有限和寶貴，如果血站實驗室灰區設置不合理，勢必造成一定血液資源的浪費；也會造成獻血者流失[4]。

近年來，血站系統很多實驗室對所用試劑進行灰區設置的探討[5-9]，通過對灰區標本進行確證實驗和灰區獻血者進行追蹤，結論不盡相同。我們實驗室通過對血清盤結果進行分析，比較設置灰區和不設灰區兩種情況下八種ELISA 試劑的靈敏度、特異性和約登指數。

血清盤的檢測結果表明，兩種HBsAg 試劑灰區設置為S/CO=0.7 時靈敏度為84.6%和79.4%，特異性為95.7%和97.3%，不設灰區時為S/CO=1時靈敏度為82.3%和76.8%，特異性為97.9%和98.4%。我們所用兩種HBsAg 試劑對血清盤的檢測中均存在一定比例的假陰性標本。抗-HCV 試劑1和試劑2 灰區設置為S/CO=0.7 時靈敏度為99.7和99.1%，特異性為88.4%和92.9%，臨界值S/CO=1 時靈敏度為99.7%和99.7%，特異性為92.9%和93.5%。不設置灰區時靈敏度和特異性相比設置灰區時靈敏度和特異性有所提高。HIV 試劑1 和試劑2 灰區設置為S/CO=0.7 時和不設灰區時為S/CO=1時靈敏度是一致的，特異度在S/CO=1 時有所提高，特別是HIV 試劑2 的靈敏度為100%，特異性在取消灰區設置后為92.3%。HIV 試劑1 的特異性在取消灰區設置后也提高到97.4%。抗-TP 試劑1和試劑2 的靈敏度和特異性灰區存在與否時基本一致，靈敏度為99.7%，特異性為82.8%~88.2%，存在一定的假陽性標本，且大部分假陽性標本的S/CO＞1。由此可知，HBsAg 試劑有必要設置灰區，并需要提高試劑的靈敏度，而抗-HCV、HIV 和抗-TP ELISA 試劑取消灰區設置。

本文參照文獻[10]中的方法，計算在不同S/CO值下試劑的靈敏度、 特異性及約登指數，約登指數=（靈敏度+特異度）-1，以 S/CO 值為橫坐標，約登指數為縱坐標，繪制曲線，觀察每種試劑在最大約登指數下的S/CO 值。8 種ELISA 試劑最佳臨界值分別為 HBsAg 試劑的最佳臨界值為0.2~0.3，抗-HCV 試劑的最佳臨界值為1，HIV 試劑的最佳臨界值為1~1.2，抗-TP 試劑的最佳臨界值為1~1.1。這與文獻[10-14]中的結果基本一致，國產HBsAg ELISA 試劑的陽性判定值為0.3，進口試劑設為0.6。11 家血站實驗室的抗-TP ELISA 試劑的結果支持取消灰區設置；關于抗-HCV 試劑灰區設置的近三年的文獻支持取消灰區設置； 對HIV 近五年灰區標本的分析結果也支持取消灰區設置。

京津冀[15]15 家血站實驗室ELISA 灰區設定調查結果顯示，除1 家血液中心，其他實驗室均設置了 ELISA 檢測灰區，主要集中在 0.7~0.85 之間。筆者認為ELISA 灰區是實驗室為更大限度檢測出陽性標本而設定的，它能夠降低因漏檢而帶來的風險，但也不可避免地淘汰一部分合格的血液。再者，ELISA 方法出現灰區除了病毒窗口期的原因還有很多因素，例如：病毒基因變異、鉤狀效應、試劑因素、人為因素[16]。

綜上，灰區設置應遵循科學性、嚴謹性和系統性。本文主要對血清盤的結果進行灰區設置合理性的分析，目前我們實驗室針對HBsAg 血清盤的結果做了詳細分析[17]，結果和本文一致。還需要補充無償獻血者的樣本的結果分析，下一步會進行確證實驗和結果分析，進一步探討ELISA 灰區設置的意義。