對SPRINTERXL/Europattern系統(tǒng)檢測抗核抗體性能驗證

陳甜甜，張春雷，占葆娥，曾學(xué)輝，張書楠，陳桂冰

（深圳市中醫(yī)院檢驗科，廣東 深圳 518001）

間接免疫熒光法 （indirect immunofluorescence，IIF）法是檢測抗核抗體(（Antinuclear Antibody，ANA)的參考方法和首選方法[1]。而 IIF 手工操作模式容易受到試劑、操作、顯微鏡、判讀經(jīng)驗、質(zhì)量控制和滴度系統(tǒng)等多方面的影響，較難實現(xiàn)結(jié)果互認。SPRINTER XL+Europattern 全自動熒光免疫分析系統(tǒng)，是歐蒙醫(yī)學(xué)診斷（中國）推出的全自動間接免疫熒光操作/酶聯(lián)免疫一體機和全自動免疫熒光核型及滴度判讀系統(tǒng)。本研究依據(jù)WS/T 505-2017《定性測定性能評價指南》[2]和《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認可準則在臨床免疫學(xué)定性檢驗領(lǐng)域的應(yīng)用說明》[3]的具體要求，在全自動熒光免疫分析系統(tǒng)的基礎(chǔ)上建立抗核抗體性能驗證的方案，對檢測系統(tǒng)檢出限、診斷符合率和精密度（批內(nèi)精密度和中間精密度）進行評價,具體報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗樣本 收集近4 年衛(wèi)生部臨檢中心室間質(zhì)評樣本1511-1515,1521-1525,1611-1615,1621-1625,1711-1715，1721-1724，1811,1813,1814,1821,1822，健康體檢人群陰性樣本8 例。ANA 顆粒陽性樣本1 例（滴度 1:1000），顆粒弱陽性樣本 1 例（滴度 1:100），均質(zhì)弱陽性樣本 1 例（滴度 1:100）。所有患者均簽署知情同意書。WHO 參考血清，WHO 66/233 ANA 核均質(zhì) 100 IU/ml；陰性質(zhì)控品，批號201801001，北京康徹思坦生物技術(shù)有限公司；陽性質(zhì)控品（核顆粒），批號20180918，廣州市康潤生物制品開發(fā)有限公司。

1.2 儀器和試劑 儀器：全自動熒光免疫分析系統(tǒng)（SPRINTER XL+Europattern，歐蒙醫(yī)學(xué)診斷(中國)有限公司）；試劑：抗核抗體IgG 檢測試劑盒（間接免疫熒光法），批號 CF171031AE，歐蒙(杭州)醫(yī)學(xué)實驗診斷有限公司。

1.3 操作方法

1.3.1 檢出限驗證

1.3.1.1 實驗方案 將100IU/ml 的WHO 參考血清用PBS 按照1:2,1:3,1:4 稀釋，將陽性檢測結(jié)果最低稀釋度（稀釋度1:3，濃度33.33IU/ml）每天檢測4次，連續(xù)檢測5d，計算陽性檢出率。

1.3.1.2 判斷標準 陽性檢出率≥95%的稀釋倍數(shù)對應(yīng)的濃度為改檢測系統(tǒng)的檢出限。

1.3.2 診斷符合率驗證

1.3.2.1 實驗方案 用全自動熒光免疫分析系統(tǒng)收集并檢測衛(wèi)生部近年室間質(zhì)評血清34 例（其中陽性樣本20 例，陰性樣本14 例。全部樣本室溫自然解凍，離心取上清，實驗前由2 名具有10 年以上工作經(jīng)驗的技術(shù)人員手工檢測復(fù)核，結(jié)果與往年室間質(zhì)評上報結(jié)果一致方能入選），體檢陰性樣本6 例，評估符合率。

1.3.2.2 判斷標準 陰性符合率≥80%，陽性符合率為≥80%。

1.3.3 精密度驗證

1.3.3.1 精密度驗證方案 選取抗核抗體陰性樣本2 份、弱陽性樣本2 份、陽性樣本1 份共5 份樣本。每份樣本同時檢測20 次計算陰陽性符合率評估批內(nèi)精密度；5 份樣本每天檢測4 次，連續(xù)檢測5天計算陰陽性符合率評估中間精密度。

1.3.3.2 判斷標準 陽性血清檢測的結(jié)果，要求特異性、熒光強度基本一致（不超過一個梯度），陰性血清檢測的結(jié)果為陰性。

1.3.4 質(zhì)控 每批次實驗須同時檢測陰、 陽性質(zhì)控品及陰、陽性對照。質(zhì)控品和對照結(jié)果應(yīng)與預(yù)期結(jié)果一致，否則應(yīng)重新實驗。

1.3.5 結(jié)果判讀 樣本、 質(zhì)控品和對照嚴格按照說明書由SPRINTER XL 完成稀釋及加樣、 洗板，封片，由Europattern 自動判讀結(jié)果，并由2 名工作10年以上的檢驗醫(yī)生復(fù)核，以人工復(fù)核的結(jié)果為準。

1.4 結(jié)果統(tǒng)計 最低檢出限采用IU/ml 表示，符合率和精密度采用百分率表示。

2 結(jié)果

2.1 檢出限驗證結(jié)果

表1 檢出限驗證結(jié)果

2.2 診斷符合率驗證結(jié)果

2.3 精密度驗證結(jié)果

3 討論

ANA 陽性常見于系統(tǒng)性或器官性自身免疫性疾病，也可見于感染、 腫瘤患者以及部分健康人群，檢測ANA 對自身免疫性疾病的診斷、鑒別診斷、 分型以及活動性監(jiān)控都有重要意義。IIF 檢測ANA 采用的檢測基質(zhì)為人喉癌上皮細胞，其抗原成份豐富，可以檢測大量自身抗體[4]，在臨床被廣泛采用。但目前國內(nèi)實驗室檢測現(xiàn)狀看，基于IIF方法檢測ANA 的性能驗證研究較少、性能驗證方案尚未形成共識、不同實驗室之間ANA 滴度結(jié)果的可比性差，缺乏統(tǒng)一的規(guī)范和標準，較難實現(xiàn)臨床不同醫(yī)療機構(gòu)之間的檢驗結(jié)果互認。近年衛(wèi)生部室間質(zhì)評回報結(jié)果也顯示ANA 準確率高，但滴度結(jié)果實驗室之間可比性差[5-8]。

CNAS-CL02-A004：2018 《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認可準則在臨床免疫學(xué)檢驗領(lǐng)域的應(yīng)用說明》對定性實驗性能驗證提出要求，實驗室至少應(yīng)對檢出限和符合率進行驗證。檢出限是由給定測量程序得到的測得量值，對于此值，在給定聲稱物質(zhì)中存在某成分的誤判概率為α 時,聲稱不存在該成分的誤判概率為β，表明檢測系統(tǒng)識別陰、陽性的濃度，但目前ANA 多數(shù)廠家試劑說明書并沒有這個參數(shù)。本研究采用WHO 參考血清做梯度稀釋，能夠較準確的反應(yīng)檢測系統(tǒng)的檢出限，適用于不同實驗室、 不同方法學(xué)和不同試劑廠家之間進行比對。符合率是檢測系統(tǒng)最主要的性能參數(shù)，本研究主要采用衛(wèi)生部室間質(zhì)評樣本進行符合率驗證，并參照室間質(zhì)評合格標準，擬定了驗證合格標準為大于等于80%。在符合率驗證過程中，筆者不建議自己留樣，應(yīng)選擇國家衛(wèi)生部臨檢中心、各省市臨檢中心室間質(zhì)評樣品、 可朔源的企業(yè)參考品或?qū)I(yè)公司的全球質(zhì)評樣本、 或來源其它已通過15189 認可的實驗室。

表2 診斷符合率驗證結(jié)果

表3 精密度（重復(fù)性）驗證結(jié)果

ANA 檢測的自動化、標準化、信息化及實驗室之間的結(jié)果互認是實驗室的發(fā)展趨勢。本研究中探討ANA 的性能驗證方案建立在歐蒙全自動熒光免疫分析系統(tǒng)（SPRINTER XL+Europattern）的平臺上，該檢測系統(tǒng)的自動化及標準化程度很高，具有很多優(yōu)點。第一，研究中對陰性、1:100，1:1000 兩種不同滴度不同核型樣本進行批內(nèi)、 批間多次檢測，檢測滴度和核型一致率100%，表明該檢測系統(tǒng)檢測具備良好的重復(fù)性，結(jié)果判讀識別穩(wěn)定。第二，近期在該檢測系統(tǒng)與人工判讀的比對試驗中發(fā)現(xiàn)，判讀系統(tǒng)與人工判讀在單一核型和復(fù)合核型都有較高的一致性[10]，表明該系統(tǒng)自動判讀結(jié)果穩(wěn)定可靠，具備良好的準確性。第三，該判讀系統(tǒng)采用透射光LED 光源，光源壽命長，使用壽命內(nèi)光強穩(wěn)定、無衰減，克服傳統(tǒng)汞燈光源自然衰減過程中引起的滴度判讀差異。筆者認為，只有建立在一個可靠分析系統(tǒng)基礎(chǔ)之上的性能驗證方案才能夠有效保證實驗室的檢測質(zhì)量。歐蒙全自動熒光免疫分析系統(tǒng)（SPRINTER XL+Europattern）克服了傳統(tǒng)的手工操作在不同實驗室之間或同一實驗室內(nèi)部不同員工操作精度和主觀判斷的影響,保證了準確性和重復(fù)性，值得推廣。

目前,ANA 檢測的臨床篩查價值越來越大[11-17],在持續(xù)推進ANA 檢測質(zhì)量的過程中，還有大量的工作需要同步推進。第一，ANA 檢測標準化在制度上必須保證對技術(shù)人員的標準化培訓(xùn),如衛(wèi)生部臨檢中心及各省市臨檢中心等職能部門不斷規(guī)范ANA 檢測滴度稀釋系統(tǒng)。第二，不斷改進室間質(zhì)評方案，室間質(zhì)評樣本應(yīng)包括《抗核抗體檢測的臨床應(yīng)用專家共識》 建議的13 種必報核型以及15 種選報核型[1]，對難以收集的樣本可采用圖片等方式不斷提高實驗室判讀水平[9]等。第三，實驗室內(nèi)部應(yīng)加強對檢測系統(tǒng)的性能驗證和人員比對。只有規(guī)范化的培訓(xùn)和標準化的操作,才能夠持續(xù)不斷的提高和保證實驗室檢測質(zhì)量。

綜上所述，SPRINTER XL+Europattern 全自動熒光免疫分析系統(tǒng)自動化程度高，判讀準確，排除了手工操作和主觀判讀等因素影響，驗證結(jié)果表明各性能指標能夠滿足要求，此檢測系統(tǒng)能夠適用于臨床檢測，應(yīng)大力推廣。