外周血與尿沉渣microRNA-145 表達與冠心病患者疾病程度的相關性研究

魏艷勝，張永春，黃陸力，王學惠，張俊彪，劉輝

（新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心內科，河南 新鄉(xiāng) 453100）

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，冠心病(coronary atherosclerotic heart disease，CAD)是指因動脈粥樣硬化或動力性血管痙攣引發(fā)的冠狀動脈器質性狹窄、阻塞或供血不足，最終導致心肌缺血缺氧(心絞痛)或心肌壞死(心肌梗塞)等心肌機能障礙的心臟病，嚴重威脅人群的身體健康，是全球死亡率最高的疾病之一[1,2]。冠心病的診斷主要依賴典型的臨床癥狀結合輔助檢查，證實心肌缺血或冠脈阻塞的，以及是否有心肌壞死[3]。臨床上治療冠心病的目的是緩解癥狀，減少心絞痛的發(fā)作及冠心病；延緩冠狀動脈粥樣硬化病變的發(fā)展，并減少冠心病死亡，早期診斷和合理預防對冠心病的治療及預后具有十分重要的意義。目前臨床上廣泛采用總膽固醇（TC）、 低密度脂蛋白 （LDL-C）、 高密度脂蛋白（HDL-C）、甘油三酯（TG）、B 型利鈉肽前體（Pro-BNP），肌鈣蛋白 I （cTnI）、肌酸激酶同工酶（CKMB）等生化標記物來評估CAD 患者的疾病發(fā)展情況，然而這些指標在非CAD 的敗血癥、肺栓塞等危重疾病患者中亦出現(xiàn)升高[4]。而microRNAs 作為基因表達的調節(jié)劑,近年來已經(jīng)發(fā)展為一個生物腫瘤治療領域的新靶點,廣泛參與并有效涉及多種生物及細胞的增殖、分化、凋亡代謝自我更新等過程[5]，國內外研究表明，microRNA-145 在心肌缺血缺氧和復氧損傷的調控機制中發(fā)揮重要的作用[6]。本研究通過收集2016 年1 月-2017 年 12 月本院收治的100 例冠心病患者的血清和晨尿,旨在探討血清和尿沉渣 miR-145 用于冠心病診斷、 治療及預后的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床一般資料 2016 年 1 月-2017 年 12 月本院收治的100 例冠心病患者作為觀察組，診斷標準及入選標準，并依據(jù)NYHA 分級法進行分級，IIV 級，診斷標準符合2014 年美國和歐洲穩(wěn)定性冠心病診治指南的診斷及分類診斷標準[7]：冠心病確診為冠脈造影時左主干、前降支、回旋支、右冠脈或其主要分支的血管直徑狹窄(至少1 支冠狀動脈直徑狹窄＞50%)。入選標準：⑴經(jīng)頭CT 排除腦出血及其他腦性疾病;⑵近1 個月內未服用過任何類型的抗凝藥物和影響纖溶活性的藥物,未服用過任何類型的抗生素、激素、非甾體抗炎藥等；⑶患者不具有肝、腎功能不全，貧血、腫瘤，凝血功能異常及自身免疫性疾病、甲狀腺功能障礙等；(4)無手術外傷史。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，患者自愿簽署知情同意書。以同期98 例于我院行健康體檢者為對照組。見表1。

表1 兩組對象一般資料比較

1.2 樣品收集 所有患者均在我科進行基礎藥物及溶栓治療：抗血小板、利尿劑、血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEI）、β 受體阻滯劑等，患者給予臥床休息、吸氧、低鹽低脂飲食、心電及血氧飽和度監(jiān)測等。清晨空腹采集各組患者靜脈血 5ml，2000rpm/min 離心15min，取上層血清待檢。收集各組患者晨起中段尿10ml,2000rpm/min 離心15min，取尿沉渣用于提取RNA。

1.3 觀察指標 采用全自動生化分析儀檢測患者血清中的總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）、甘油三酯（TG）、B 型利鈉肽前體（Pro-BNP）,肌鈣蛋白 I （cTnI）、肌酸激酶同工酶 （CK-MB）。Trizol 法提取血液和尿液內總RNA，用含有gDNA 橡皮擦功能的PrimeScriptRT試劑盒進行逆轉錄, 合成cDNA 進行并擴增，以U6snRNA 為內參照基因，用SYBR Premix Ex TaqII試劑盒按照說明書操作，進行實時熒光定量Realtime PCR 分析。每個實驗至少重復3 次。分析:通過計算miR-145 基因的表達含量。取1μg 總RNA 利用M-MLV 逆轉錄酶說明書反轉錄合成cDNA，內參選用U6。逆轉錄引物序列miR-145：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCG AGGTATTCGCACTG -GATACGACCGCGAGG-3'，采用 AB I7000 實時定量PCR 儀進行逆轉錄。RT-PCR 反應引物序列miR-145： 上游引物序 5'-GGCTTC GTA CCG TGAGTAAT-3'，下游引物序列5'-GTGC AGGGTC CGAGGT-3'；U6：上游引物系列 5'-GCTTCGGCAG CACATATACTACATATACTAAAAT-3',下游引物序列 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。反應體系：95℃孵育 30s，循環(huán)程序共 40 個循環(huán)，變性95℃，15s；退火 60℃，20s；延伸 70℃，60s。每個樣本均進行三次檢測，應用2-△△CT法計算miRNA-145的相對表達水平并對其進行 log2-△△CT轉換，ΔΔCT=實驗組(CTmiRNA-145-CTU6)-對照組(CT-miRNA-145-CTU6)，采用-ΔΔCT 表達 MicroRNA-145 的相對水平。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料符合正態(tài)分布和方差齊性檢驗，計量資料結果用±s 表示，采用單因素方差分析和T 檢驗進行計量資料組間差異比較。計數(shù)資料采用例數(shù)（%）表示，組間差異采用卡方檢驗，診斷實驗評價采用ROC 曲線的繪制；miR-145 與冠心病分期及術后復發(fā)的關系使用兩兩直線相關性分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 入院指標檢測比較 相比于對照組, 觀察組miRNA-145 含量升高（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組對象入院指標檢測比較

2.2 觀察組血清內miR-145 mRNA 含量表達 隨著NYHA 分級加重，患者血清中的miR-145 mRNA 含量表達顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。患者采用常規(guī)方法治療后，患者血清中的miR-145 mRNA 含量表達顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 觀察組血清內miR-145 mRNA含量表達

2.3 觀察組尿沉渣中miR-145 mRNA 含量表達隨著NYHA 分級加重，患者尿沉渣中的miR-145 mRNA 含量表達顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。患者采用常規(guī)方法治療后，患者尿沉渣中的miR-145 mRNA 含量表達顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表4。

2.4 血清及尿沉渣中miR-145 診斷價值 觀察組血清miR-145 診斷曲線下面積AUC 為0.79，靈敏度為75.00%，特異性為80.00%。觀察組尿沉渣中miR-145 診斷曲線下面積AUC 為0.62，靈敏度為65.00%，特異性為72.00%，見表5。

表4 觀察組尿沉渣中miR-145 mRNA含量表達

表5 血清及尿沉渣中miR-145 診斷價值

2.5 血清及尿沉渣中miR-145 與觀察組疾病程度的相關性 隨著冠心病患者NYHA 分級的加重，觀察組血清及尿沉渣中miR-145 mRNA 含量與患者疾病程度呈明顯負相關（P＜0.05），見表6。

表6 血清及尿沉渣中miR-145 與觀察組疾病程度的相關性

2.6 血清及尿沉渣中miR-145 與觀察組冠狀動脈粥樣硬化的相關性 隨著冠心病患者NYHA 分級的加重，觀察組血清及尿沉渣中miR-145 mRNA含量與患者 TC、LDL-C、CK-MB、CTnl 及 Pro-BNF含量呈明顯負相關，與患者HDL-C 和TG 含量呈明顯正相關（P＜0.05），見表7。

表7 血清及尿沉渣中miR-145 與觀察組冠狀動脈粥樣硬化的相關性

3 討論

近年來，大量研究表明miRNA 表達的上調或下調足以引起一些特異性的心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展，包括促進血管內皮細胞的發(fā)育、分化、增殖和凋亡等多種生物學過程[8]。miR-145 是血管內皮上的特殊的miRNA,其靶基因 Ephrin-A3 是 VEGF介導血管新生信號通路的重要信號分子,參與調控Hif-1a-VEGF 信號通路，miR-145 在心梗后的血管發(fā)生和維持血管的完整性上起著重要作用[9,10]。

miR-145 位于染色體 11p15.5 染色體上AK123483 基因轉錄生成的非編碼 RNA 內含子內，是當前公認的缺氧特異miRNA，是目前科學界公認的一種特異性缺氧miRNA，亦能夠在機體缺氧的情況下用于調節(jié)血管內皮細胞生成的關鍵因素[11]。在機體處于缺氧和受 Hif1-a 直接刺激條件下,miR-145 的表達穩(wěn)定增加,通過抑制 EphrinA3，促進內皮細胞形成血管, 促進血管新生, 能促進VEGF 誘導的HUVECs 遷移,這對促進血管再生有重要作用[12,13]。相關研究發(fā)現(xiàn)[14]，尿沉渣中的miRNA具有更好的抗解性，能夠在室溫下長期儲存，甚至能夠多次凍融。本研究結果表明，隨著冠心病患者NYHA 分級的加重,觀察組血清和尿沉渣miR-145 mRNA 含量表達顯著下降；患者采用常規(guī)方法治療后，觀察組血清和尿沉渣miR-145 mRNA 含量表達顯著升高，說明miR-145 的表達受缺氧誘導，調控缺氧反應相關基因的表達,有效提示患者機體內的缺血缺氧性損傷。曾令勇[15]等人亦研究miR-145在心肌梗死大鼠心肌組織中的表達明顯下降，上調miR-145 表達可抑制心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡。此外本研究結果亦發(fā)現(xiàn)顯示，觀察組血清及尿沉渣中miR-145 mRNA 含量與患者疾病程度呈明顯負相關； 觀察組血清及尿沉渣中miR-145 mRNA 含量與患者 TC、LDL-C、CK-MB、CTnl 及 Pro-BNF 含量呈明顯負相關，與患者HDL-C 和TG 含量呈明顯正相關，說明miR-145 表達與患者的治療及預后情況明顯相關,可有效提示觀察組冠心病及冠狀動脈粥樣硬化的損傷程度。同時，觀察組血清miR-145 診斷曲線下面積AUC 為0.78，靈敏度為75.00%, 特異性為80.00%。觀察組尿沉渣中miR-145 診斷曲線下面積AUC 為0.64，靈敏度為65.00%, 特異性為72.00%。說明血清和尿沉渣miR-145 在診斷的特異性及敏感性方面有一定的優(yōu)勢,預示著血清和尿沉渣miR-145 可能作為判斷冠心病的無創(chuàng)診斷指標。

綜上所述,血清和尿沉渣miR-145 可用于作為診斷冠心病的生物學標志物,對于臨床判定冠心病患者分期、治療及復發(fā)具有重要的輔助作用。