ALL多探針系統在兒童急性淋巴細胞白血病診療中的應用價值

李林飛，王朦，宋銀森，史利歡，趙鼎

（鄭州大學附屬兒童醫院 河南省兒童遺傳代謝性疾病重點實驗室 鄭州兒童醫院，河南 鄭州450000）

急性淋巴細胞白血病 (acute lymphoblastic leukemia,ALL)是一種主要起源于B 系或T 系淋巴祖細胞在骨髓內異常增生的惡性腫瘤性疾病，約占兒童急性白血病的80%以上。0～9 歲兒童為發病高峰，污染區、油田等地區發病率明顯偏高。小兒ALL 最多見為 L1 型，占 70%，L2 型為 25%左右，L3 型占5%以下。

近年來根據ALL 分型制定個體化方案已取得較好療效，5 年生存率高達80%以上。因此，及早經骨髓形態學、免疫學、遺傳學、分子生物學等技術手段明確ALL 可疑兒童診斷與分型，有助于提高其預后及改善生活質量，其中分子細胞遺傳學檢測是ALL 明確診斷與預后評估必不可少的手段。我們采用ALL 多探針技術對本地區173 例初診ALL 兒童分子細胞遺傳學改變進行探究，以了解ALL 多探針系統在兒童ALL 診療中的應用價值。

1 對象與方法

1.1 對象 2017 年 2 月-2019 年 1 月在我院血液腫瘤科住院期間初診ALL 兒童患者173 例，其中男性98 例，女性75 例，男女比例1.31:1，最大年齡14 歲，最小年齡僅3 個月。所有患者診斷均嚴格按照《血液病診斷和療效標準》第2 版。本研究經鄭州兒童醫院倫理委員會批準，并均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 ALL 多探針系統檢測 ALL 多探針系統共包括 cMYC 斷裂點探針、P16 缺失探針、E2A 斷裂點探針、CHIC2/D10Z1/D17Z1 超二倍體探針、TEL/AML1 雙融合探針、MLL 斷裂點探針、BCR/ABL1雙融合探針及IGH 斷裂點探針8 組探針（英國Cytocell），按特定設計分別固定于一張標準化檢測玻片上。該檢測采用多探針FISH 技術對初診ALL 患兒骨髓標本進行處理、細胞收獲、制片、變性、雜交、洗脫、熒光染色等操作。

1.2.2 熒光顯微鏡觀測 在Leica GSL-10 全自動工作站熒光顯微鏡下通過三色濾光模塊觀察雜交信號, Cytovision 軟件進行熒光圖像分析，每種探針分別計數200 個細胞，陽性細胞所占比例超過10%可判為陽性結果。

2 結果

ALL 多探針系統對173 例初診ALL 兒童檢測中，共檢出112 例陽性改變，陽性率為64.74%，分別涉及 cMYC、P16、E2A、TEL/AMLl、CHIC2/D10Z1/D17Z1、MLL、BCR/ABL1、IGH 等 8 種單一陽性改變109 例或合并至少兩種陽性改變3 例，其中CHIC2/D10Z1/D17Z1 超二倍體檢測陽性率最高，共76 例，陽性率為 43.93%，其次是 TEL/AMLl 陽性，共19 例，陽性率為10.98%，另檢出8 例信號異常，但均未發現陽性異常。112 例兒童ALL 多探針系統FISH 陽性結果，見表1，另本檢測中檢出1 例患兒BCR-ABL1 融合基因陽性，見圖1。

表1 112 例兒童ALL多探針系統FISH陽性結果

圖1 1 例BCR/ABL1 融合基因陽性患兒ALL多探針檢測結果

3 討論

急性淋巴細胞白血病 (acute lymphoblastic leukemia, ALL) 是兒童時期最常見的血液系統惡性腫瘤，其白血病的發生、發展起源于不同淋巴祖細胞的惡性改變，病因及發病機制尚不明確[1,2]。通常認為，白血病的發生是多種遺傳與環境因素相互作用的結果[3],主要與以下危險因素有關:遺傳及家族因素，環境因素(電離輻射、化學致癌物、病毒感染等)，基因改變(染色體異常、點突變等)。大約60%-85%的ALL 患者可檢出克隆性染色體異常，其中多數為特異性染色體重排。ALL 特異細胞遺傳學改變與其不同生物學特性及預后有明顯相關性，具有重要的臨床和生物學意義。本研究旨在探討ALL 多探針系統在兒童急性淋巴細胞白血病診療中的應用價值，通常涉及分子細胞遺傳學改變包括融合，斷裂、缺失及超二倍體等。

在173 名初診ALL 兒童中，我們檢測到兒童CHIC2/D10Z1/D17Z1 超二倍體陽性最多,共76 例，陽性率為43.93%。超二倍體是指除正常染色體組以外,還有一條或幾條額外的染色體或染色體片段的細胞或個體，部分ALL 患者攜帶超二倍體。大多數此型患者白細胞計數不高，化療效果好，預后較好。雖然超二倍體可累及任何一條染色體，但以4、6、10、14、17、18、20、21 及 X 染色體最常見[4],美國CDG 研究組亦發現，第 4、10、17 對染色體三體是獨立的預后良好的因素[5]。

其次是TEL/AML1 陽性，共19 例，陽性率為10.98%。文獻報道，TEL/AML1 是兒童 ALL 中最常見的異常融合基因，見于12%~27%的兒童B 細胞急性淋巴細胞白血病[6]。該類陽性患者具有早期白細胞計數不高，化療效果佳，完全緩解期長，早期不易復發等臨床特點，因此檢測到TEL/AML1 陽性預示預后良好。本組陽性率結果低于文獻報道，可能與初診ALL 納入標準及標本量有關，也應重視ALL 多探針檢測本身技術的特點使其對標本中陽性細胞的個數及熒光信號的質量非常依賴,需在熒光顯微鏡下計數200 個熒光細胞,陽性細胞超過閾值才提示標本陽性，警惕玻片前處理不當、熒光信號差、閾值差異、人為計數誤差等原因均可導致假陰性出現。一般來說,傳統核型幾乎無法檢出TEL/AML1 異常,主要是由于該易位片段十分微小[7],故此融合基因檢測相對更有意義和價值。

另ALL 多探針系統可檢出MLL(11q23)基因異常，MLL 斷裂點異常在兒童ALL 中占2%~6%，其畸變類型包括缺失,插入,重復及易位[8]。MLL 易位重排相關的基因眾多,,常見的有AF4(4q21)、AF6(6 q27)、AF9(9p21-22)、AF10(10p12)和 ENL(19p13.3)等, 這些基因通常與MLL 基因發生易位后可形成MLL 融合基因導致白血病的發生[9]。本組ALL 患者的MLL 陽性率為4.62%, 與文獻報道基本相符[10]。此型患者臨床表現較典型: 初診時白細胞計數高,常規化療效果不好, 且對大劑量糖皮質激素耐藥,完全緩解率低，生存期短[11]。所以檢測到此類異常的患者一般預后較差，特別是幼兒患者預后更差。

其余分子細胞遺傳學異常包括cMYC 斷裂點陽性、P16 基因缺失、E2A 斷裂點陽性、BCR/ABL融合基因陽性、IGH 斷裂點陽性, 絕大多數白血病患者檢測到此類異常通常提示預后不良。cMYC 基因位于8q24[12],在B 細胞ALL 中往往出現其與IgK(2p13)、IgH(14q32)、Igλ(22q11)等 Ig 基因之間的相互易位，從而組成一個重排基因，具有高轉活性，啟動cMYC 轉錄并增強cMYC 表達,最終導致細胞惡變及腫瘤發生。P16 基因位于9p21，該缺失將會引起很多腫瘤病，可導致兒童ALL 的發生。E2A 基因位于 19p13，PBX1(1q23)和 HLF(17q22)可與其發生融合，導致t(1;19)和t(17;19)易位，前者在兒童B急淋中更多見，且該型較易復發。BCR/ABL 融合基因是9 號染色體和22 號染色體易位產物[13]，3-5%的兒童ALL 患者會出現該異常。IgH 基因位于14q32，可與多種染色體如1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 11,12, 13, 14, 17, 18, 19 和22 等形成不同的染色體融合, 其中最常見的易位為IgH/BCL2 和IgH/CCND1，另IGH 探針能夠檢出各種形式的IgH 重排。

因此，ALL 多探針系統是兒童急性淋巴細胞白血病診療中較好的檢測手段。首先，由于ALL 多探針是應用多種已知與白血病相關的核酸序列作為探針，與靶DNA 進行FISH 雜交，只需簡單觀察熒光信號數目即可進行ALL 診斷，檢測結果也更加客觀、準確、可靠。其次，ALL 多探針系統檢測白血病患者骨髓液是否存在遺傳學改變,相比于骨髓細胞核型分析中常出現的可分析分裂象少,染色體粗短,分散不良、容易培養失敗等現象[14],成功率幾乎100%。另外，應用ALL 多探針系統常在獲取標本后1~2d 便可得出結果,與傳統的核型分析（2~3周）相比在時間上大大縮短[15]，從而減輕患兒家屬等待結果期間的不安和焦慮,同時縮短疾病的診療周期。

綜上所述, 兒童ALL 患者分子細胞遺傳學改變不盡相同，其疾病表現、免疫分型、對治療的反應及臨床預后也各有不同。ALL 多探針系統可一次性檢出多種與兒童ALL 相關的細胞遺傳學改變，不僅準確、高效、省力、省時，而且檢測效率極高，臨床實用性強，非常有利于兒童ALL 患者的細胞遺傳學診療及預后評估,在協助其精準診療中具有較強的應用價值。