IL-32α 通過調控miR-216b-5p/AKR1B10 軸抑制食管癌KYSE450 細胞的增殖、遷移和侵襲

吳光鋒，范瑞

（南陽市第一人民醫院，河南 南陽 473000）

食管癌是消化系統常見的惡性腫瘤,中晚期患者5 年生存率低于10%[1]。依據組織形態學的不同，可將食管癌分為食管腺癌和食管鱗狀細胞癌，其中食管鱗狀細胞癌約占食管癌的90%[2]。腫瘤周圍浸潤的免疫細胞和其分泌的大量炎性因子可促進腫瘤的發生和發展,抑制機體對腫瘤細胞的免疫識別[3,4]。研究顯示，多種炎癥介質參與食管癌的發展進程[5,6]。IL-32 是一種促炎細胞因子，包含IL-32α、IL-32β、IL-32γ 等 6 種亞型, 其中 IL-32α 是最主要的亞型[7]。IL-32 的不同亞型在腫瘤、自身免疫疾病、炎癥性腸病等疾病中發揮不同作用，參與細胞增殖、凋亡及炎癥反應等過程[8,9]。一定劑量范圍的IL-32α 可能通過抑制Jak2/ STAT3 信號通路抑制胰腺癌Panc-1 和AsPC-1 細胞的侵襲和轉移[10]。IL-32α 通過促進 TNFR1 的信號傳導來抑制結腸癌的發展[11]。但目前，IL-32α 對食管癌細胞生物學行為的影響和機制還未知。

微小 RNA （microRNA，miRNA） 是長度約為18～25 個核苷酸的小分子非編碼單鏈RNA,參與調控細胞生物學行為,在腫瘤的發生和發展中發揮重要作用[12]。研究顯示，miR-216b-5p 過表達可抑制胰腺癌細胞增殖，誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡，并抑制體內腫瘤發生[13]；miR-216b-5p 表達的上調可抑制宮頸癌細胞的增殖，并促進其凋亡[14]。但目前，miR-216b-5p 對食管癌細胞生物學行為的影響還未知。生物信息學軟件預測顯示，AKR1B10 可能是miR-216b-5p 的靶基因。AKR1B10 是細胞質內煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸依賴的可溶性單體氧化還原酶，屬醛酮還原酶超家族成員。研究顯示，AKR1B10 參與口腔鱗狀細胞癌[15]、肺腺癌[16]等腫瘤的發生發展，可作為腫瘤治療的潛在分子靶點。因此，本研究以食管癌KYSE450 細胞為研究對象，主要探討了 IL-32α 對 KYSE450 細胞增殖、遷移和侵襲的影響，并以miR-216b-5p/AKR1B10 軸為切入點，探究了 IL-32α 影響 KYSE450 細胞增殖、遷移和侵襲的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑 食管癌細胞株KYSE450 細胞，上海吉凱基因化學技術有限公司；胎牛血清，杭州四季青公司；RPMI 1640 培養基，美國Gibco 公司；鼠抗人醛酮還原酶家族1B10（AKR1B10）單克隆抗體，美國 Abcam 公司；鼠抗人 P21、CyclinD1、MMP-2、MMP-9 單克隆抗體，美國 Santa Cruz 公司；LipofectamineTM 2000 試劑盒和 Trizol 試劑，美國Invitrogen 公司； 逆轉錄試劑盒和PCR 試劑盒，大連寶生物工程公司；miR-216b-5p 模擬物（mimics）及模擬對照序列（miR-NC）、miR-216b-5p 抑制劑（anti-miR-216b-5p）及抑制劑陰性對照序列（antimiR-NC）、AKR1B10 小干擾 RNA（si-AKR1B10）及亂序無意義核苷酸序列（si-NC），上海GenePhama公司；雙熒光素酶活性檢測試劑盒，北京百奧萊博科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養和轉染 KYSE450 細胞復蘇后，培養于含10% FBS 的RPMI 1640 培養基中，置于37℃、5%CO2、97%濕度的培養箱中培養。每 2～3d 更換一次新鮮的培養基。待細胞融合至80%時，0.25%胰蛋白酶消化，按照1:3 的比例傳代培養。將對數生長期的KYSE450 細胞以每孔1×105個接種于6 孔板中，待細胞融合至60 %時，更換不含FBS的 RPMI 1640 培養基。參照 LipofectamineTM2000試劑盒說明書，分別將miR-216b-5p mimics、miRNC、si -AKR1B10、si -NC、anti -miR -216b -5p 和anti-miR-NC 轉染至 KYSE450 細胞。轉染 6h 后，更換含10% FBS 的RPMI 1640 培養基。繼續培養24h 后，收集細胞用于后續實驗。

1.2.2 細胞分組處理 未轉染的KYSE450 細胞分為對照組和IL-32α 組。對照組細胞正常培養24h,不做任何處理；IL-32α 組： 分別含 IL-32α 終濃度為 10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml[10]的培養基培養 24h。轉染 miR-216b-5p mimics、miR-NC、si-AKR1B10、si-NC 的細胞正常培養24h, 并分別記為miR-216b-5p 組、miR-NC 組、si-AKR1B10 組和 si-NC組。轉染 anti-miR-216b-5p、anti-miR-NC 的細胞用 IL-32α 終濃度為 50μg/ml 的培養基培養 24h,分別記為 IL-32α+anti-miR-216b-5p 組和 IL-32α+anti-miR-NC 組。

1.2.3 MTT 檢測細胞增殖[17]未轉染的KYSE450細胞和轉染后的細胞均以每孔0.5×104個細胞接種于96 孔板中。按照1.2.2 分組處理，每組設置3個復孔。培養結束后，每孔加入20μl 濃度為5mg/ml 的 MTT 溶液，繼續孵育 4h 后，吸棄上清液，加入150μl DMSO 溶解結晶紫，充分混勻，于490 nm處在酶聯免疫分析儀上測定吸光度值。

1.2.4 Transwell 檢測細胞遷移和侵襲[17]未轉染的KYSE450 細胞和轉染后的細胞均用不含FBS 的RPMI 1640 培養基調整濃度為 2.5×105個/ml 的細胞懸液。遷移實驗： 取100μl 細胞懸液加入Transwell 上室，下室加入500μl 含10 %胎牛血清的RPMI 1640 培養基。培養結束后，取出Transwell 小室，吸棄培養基，棉簽擦去上層未遷移細胞，生理鹽水清洗。經多聚甲醛固定、結晶紫染色后，顯微鏡觀察。隨機選取5 個視野對細胞計數。侵襲實驗： 將Matrigel 基質膠與RPMI 1640 培養基以1:8比例稀釋，鋪于Transwell 上室。自然晾干后，加100μl 細胞懸液，剩余操作同遷移實驗。

1.2.5 qRT-PCR 檢測 miR-216b-5p 和 AKR1B10 mRNA 水平[18]Trizol 試劑提取細胞中總RNA,微量核酸儀檢測RNA 純度和濃度。參照逆轉錄試劑盒操作說明，將 RNA 逆轉錄為 cDNA。以 cDNA 為模板，進行 PCR 擴增。引物序列：miR-216b-5p 上游5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3'，下游5'-GGGGAAATCTCTGCAGGCAA-3'；U6 上 游 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGG-3'，下游 5'-GT GCTCG CTTCGGCAGC-3'；AKR1B10 上 游 5'-CCCAAAGATGATAAAGGTAATGCCATCGGT-3'，下游 5'-C GATCTGGAAGTGGCTGAAATTGGAGA-3' ；GAPD H 上游 5'-ATGACCCCTTCATTGA CC-3'，下游 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。PCR 擴增條件：95℃預變性 5mins，95℃變性 10s，60℃退火 1min，72℃延伸 30s，共計 35 個循環。miR-216b-5p 以 U6為內參，AKR1B10 以 GAPDH 為內參, 采用 2－△△Ct法計算miR-216b-5p 和AKR1B10 mRNA 的相對表達水平。

1.2.6 Western Blot 法 檢 測 AKR1B10、CyclinD1、p21、MMP-2 和 MMP-9 蛋白水平[19]RIPA 試劑提取細胞中總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。分別取30μl 蛋白溶液，沸水中煮沸 5min，行 SDS-PAGE電泳。電泳后，轉至PVDF 膜，置于5%脫脂奶粉溶液中孵育 1h。TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。加入一抗，4℃孵育過夜。TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。加入辣根過氧化酶標記的二抗，室溫孵育1 h。TBST 洗膜3 次，每次5 min。然后加入化學發光試劑避光顯影，應用Quantity One 軟件進行圖像分析。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因實驗[12]經TargetScan在線軟線預測顯示，AKR1B10 的 3’UTR 中含有miR-216b-5p 的結合位點。PCR 擴增含有miR-216b-5p 結合位點的 AKR1B10 的 3’UTR，將擴增后的片段插入PGEM-T easy 載體，構建AKR1B10的3’UTR 野生型質粒。利用基因突變技術將結合位點突變后,插入PGEM-T easy 載體,構建 AKR1 B10 的 3’UTR 突變型質粒。分別將 AKR1B10 的3’UTR 野生型、突變型質粒與miR-216b-5p mimics、miR-NC 共轉染至對數生長期的 KYSE450 細胞，轉染后6h，更換新鮮培養基，繼續培養24h 后，收集細胞。參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒，測定細胞熒光素酶活性。

1.3 統計學分析 利用SPSS.22.0 軟件分析實驗數據。符合正態分布的計量資料以（±s）表示。兩組間比較用獨立樣本t 檢驗；多組間比較用單因素方差分析,進一步兩組間比較采用LSD-t 分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IL-32α 對 KYSE450 細胞增殖、遷移和侵襲的影響 與對照組比較，IL-32α 組 KYSE450 細胞抑制率顯著升高（P＜0.05），遷移和侵襲細胞數顯著降低（P＜0.05）,CyclinD1、MMP-2 和 MMP-9 蛋白水平顯著降低(P＜0.05),p21 蛋白水平顯著升高(P＜0.05),且呈劑量依賴性。見圖1、圖2 和表1。

圖1 IL-32α 對 KYSE450 細胞中 CyclinD1、MMP-2 和 MMP-9 蛋白表達的影響

表1 IL-32α 對KYSE450 細胞增殖、遷移和侵襲及相關蛋白表達的影響（±s，n=9）

表1 IL-32α 對KYSE450 細胞增殖、遷移和侵襲及相關蛋白表達的影響（±s，n=9）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與 IL-32α 10μg/ml 組比較，bP＜0.05；與依托咪酯 IL-32α 25μg/ml 組比較，cP＜0.05

分組對照組IL-32α 10μg/ml 組IL-32α 25μg/ml 組IL-32α 50μg/ml 組F P抑制率（%）0.00±0.00 10.65±1.14a 27.45±2.31ab 44.29±4.38abc 525.870 0.000遷移細胞數（個）侵襲細胞數（個） CyclinD1 蛋白 p21 蛋白 MMP-2 蛋白 MMP-9 蛋白105.69±10.36 79.28±7.35a 59.36±5.28ab 41.02±4.57abc 131.687 0.000 89.35±8.04 63.21±6.87a 42.28±4.35ab 28.64±3.98abc 171.972 0.000 0.76±0.07 0.65±0.06a 0.52±0.05ab 0.38±0.03abc 81.555 0.000 0.25±0.03 0.39±0.04a 0.53±0.05ab 0.66±0.06abc 130.988 0.000 0.79±0.07 0.68±0.06a 0.55±0.05ab 0.36±0.03abc 103.361 0.000 0.68±0.06 0.53±0.05a 0.41±0.04ab 0.25±0.03abc 139.081 0.000

2.2 IL-32α 對 KYSE450 細 胞 miR-216b-5p 和AKR1B10 表達的影響 與對照組比較，IL-32α 組miR-216b-5p 水平顯著升高 （P＜0.05），AKR1B10 mRNA 和蛋白水平顯著降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性。見圖3 和表2。

2.3 miR-216b-5p 靶向調控AKR1B10 的表達 生物信息學軟件預測顯示，AKR1B10 的3’UTR 中含有與miR-216b-5p 互補的核苷酸序列，見圖4A。雙熒光素酶報告實驗結果顯示，miR-216b-5p 組WT-AKR1B10 的熒光素酶活性顯著低于miR-NC組 （P＜0.05），miR-216b-5p 組 MUT-AKR1B10 的熒光素酶活性與miR-NC 組比差異無統計學意義（P＞0.05）,見表3。與 miR-NC 組比，miR-216b-5p組 AKR1B10 蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；與 antimiR-NC 組比，anti-miR-216b-5p 組 AKR1B10 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），見圖4B 和表4。

圖2 IL-32α 對KYSE450 細胞遷移和侵襲的影響

圖3 IL-32α 對KYSE450 細胞中AKR1B10 蛋白表達的影響

表2 IL-32α 對KYSE450 細胞miR-216b-5p和 AKR1B10 表達的影響（±s，n=9）

表2 IL-32α 對KYSE450 細胞miR-216b-5p和 AKR1B10 表達的影響（±s，n=9）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與 IL-32α 10μg/ml 組比較，bP＜0.05；與IL-32α 25μg/ml 組比較，cP＜0.05

分組 miR-216b-5p AKR1B10 蛋白對照組IL-32α 10μg/ml 組IL-32α 25μg/ml 組IL-32α 50μg/ml 組F P 1.00±0.08 1.75±0.18a 2.04±0.21ab 2.81±0.25abc 138.669 0.000 AKR1B10 mRNA 1.02±0.08 0.79±0.07a 0.65±0.06ab 0.43±0.04abc 133.727 0.000 0.69±0.06 0.50±0.05a 0.39±0.03ab 0.26±0.03abc 150.987 0.000

圖4 miR-216b-5p靶向調控AKR1B10 的表達

表3 雙熒光素酶報告實驗（±s，n=9）

表3 雙熒光素酶報告實驗（±s，n=9）

注：與 miR-NC 組比較，aP＜0.05

分組 WT-AKR1B10 miR-NC miR-216b-5p t P 1.00±0.09 0.37±0.03a 19.922 0.000 MUT-AKR1B10 0.98±0.08 1.01±0.09 0.747 0.466

表4 miR-216b-5p對 AKR1B10 蛋白表達的影響（±s，n=9）

表4 miR-216b-5p對 AKR1B10 蛋白表達的影響（±s，n=9）

注：與 miR-NC 組比較，aP＜0.05；與 anti-miR-NC 組比較，bP＜0.05

分組 AKR1B10 蛋白miR-NC miR-216b-5p anti-miR-NC anti-miR-216b-5p F P 0.63±0.06 0.27±0.03a 0.51±0.06 0.96±0.09b 183.167 0.000

2.4 miR-216b-5p 過表達對KYSE450 細胞增殖、遷移侵襲的影響 與miR-NC 組比較，miR-216b-5p 組 miR-216b-5p 水平顯著升高（P＜0.05）,表明miR-216b-5p mimics 轉染成功,KYSE450 細胞中miR-216b-5p 過表達。與 miR-NC 組比較，miR-216b-5p 組KYSE450 細胞抑制率顯著升高 (P＜0.05), 遷移和侵襲細胞數顯著降低 (P＜0.05),CyclinD1、MMP-2 和MMP-9 蛋白水平顯著降低 (P＜0.05),p21 蛋白水平顯著升高(P＜0.05)。見圖5 和表5。

圖5 轉染miR-216b-5pmimics后KYSE450細胞中CyclinD1、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達

2.5 抑制AKR1B10 表達對KYSE450 細胞增殖、遷移侵襲的影響 與si-NC 組比較，si-AKR1B10 組AKR1B10 蛋白水平顯著降低（P＜0.05）,表明 KYS E450 細胞中 AKR1B10 表達抑制。與 si-NC 組比較，si-AKR1B10 組KYSE450 細胞抑制率顯著升高（P＜0.05）,遷移和侵襲細胞數顯著降低（P＜0.05）,CyclinD1、MMP-2 和 MMP-9 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），p21 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）。見圖6和表6。

2.6 抑制 miR-216b-5p 表達逆轉了 IL-32α（50μg/ml） 對 KYSE450 細胞增殖、 遷移侵襲的作用 與IL-32α+anti-miR-NC 組比較，IL-32α+anti-miR-216b-5p 組 KYSE450、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平和遷移、侵襲細胞數顯著升高（P＜0.05），KYSE450 細胞抑制率和p21 蛋白水平顯著降低（P＜0.05）。見圖7 和表7。

表5 miR-216b-5p過表達對KYSE450 細胞增殖、遷移侵襲的影響（±s，n=9）

表5 miR-216b-5p過表達對KYSE450 細胞增殖、遷移侵襲的影響（±s，n=9）

注：與 miR-NC 組比較，aP＜0.05

分組 miR-216b-5p 抑制率（%） 遷移細胞數（個）侵襲細胞數（個）CyclinD1 蛋白miR-NC miR-216b-5p t P 1.00±0.09 2.78±0.28a 18.157 0.000 5.39±0.55 33.58±3.36a 24.839 0.000 101.25±9.28 59.67±5.82a 11.388 0.000 92.45±8.67 39.54±3.71a 16.832 0.000 0.77±0.07 0.35±0.03a 16.545 0.000 p21 蛋白0.23±0.03 0.59±0.05a 18.522 0.000 MMP-2 蛋白0.78±0.07 0.39±0.04a 14.512 0.000 MMP-9 蛋白0.69±0.07 0.31±0.03a 14.969 0.000

圖6 轉染 si-AKR1B10 后 KYSE450 細胞中AKR1B10、CyclinD1、MMP-2 和 MMP-9 蛋白表達

圖7 IL-32α 對轉染anti-miR-216b-5p的AKR1B10 中AKR1B10、CyclinD1、MMP-2 和 MMP-9 蛋白表達的影響

表6 抑制AKR1B10 對KYSE450 細胞增殖、遷移、侵襲及相關蛋白表達的影響（±s，n=9）

表6 抑制AKR1B10 對KYSE450 細胞增殖、遷移、侵襲及相關蛋白表達的影響（±s，n=9）

注：與 miR-NC 組比較，aP＜0.05

分組 AKR1B10 蛋白 抑制率（%） 遷移細胞數（個）侵襲細胞數（個）CyclinD1 蛋白si-NC si-AKR1B10 t P 0.66±0.06 0.25±0.03a 18.336 0.000 6.87±0.61 30.59±3.28a 21.329 0.000 96.38±9.05 57.36±5.47a 11.070 0.000 87.62±8.39 42.61±4.38a 14.267 0.000 0.75±0.07 0.33±0.03a 16.545 0.000 p21 蛋白0.22±0.03 0.61±0.05a 20.065 0.000 MMP-2 蛋白 MMP-9 蛋白0.77±0.07 0.41±0.04a 13.396 0.000 0.71±0.07 0.29±0.03a 16.545 0.000

表7 抑制miR-216b-5p逆轉了IL-32α（50μg/ml）對KYSE450 細胞增殖、遷移、侵襲及相關蛋白表達的作用（±s，n=9）

表7 抑制miR-216b-5p逆轉了IL-32α（50μg/ml）對KYSE450 細胞增殖、遷移、侵襲及相關蛋白表達的作用（±s，n=9）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與 IL-32α+anti-miR-NC 組比較，bP＜0.05

分組 miR-216b-5 p AKR1B10蛋白抑制率（%）遷移細胞數（個）對照組IL-32α 組IL-32α+anti-miR-NC IL-32α+anti-miR-216b-5p 1.03±0.09 2.79±0.27a 2.83±0.26 1.67±0.17b 0.68±0.06 0.26±0.03a 0.24±0.03 0.57±0.05b 0.00±0.00 43.69±4.38a 44.08±4.87 16.85±1.74b 105.84±9.35 43.58±4.32a 40.29±4.87 79.65±7.04b侵襲細胞數（個）p21 蛋白 MMP-2 蛋白MMP-9 蛋白88.65±8.37 33.65±3.87 32.15±4.07 68.36±6.27b CyclinD1 蛋白0.74±0.07 0.36±0.03a 0.34±0.03 0.62±0.06b 0.24±0.03 0.65±0.06a 0.67±0.07 0.36±0.03b 0.81±0.07 0.38±0.04a 0.35±0.03 0.69±0.06b 0.67±0.06 0.29±0.03a 0.27±0.03 0.58±0.05b F P 158.008 0.000 223.101 0.000 182.654 0.000 196.028 0.000 194.742 0.000 135.495 0.000 159.612 0.000 170.046 0.000 187.253 0.000

3 討論

食管癌是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，其發生和發展與腫瘤微環境關系密切[20]。炎癥在組織周圍釋放的大量炎性因子參與腫瘤的生長[21]。腫瘤微環境中的多種炎性介質已用于腫瘤治療的藥物靶點,在腫瘤治療的臨床試驗中取得了一定的治療效果[22]。IL-32 是一種內源性的炎癥調控因子，可誘導IL-6、IL-8 等炎性介質的表達，在炎癥中發揮關鍵作用[23]。IL-32α 是 IL-32 的主要亞型，研究顯示,外源性的IL-32α 可抑制人黑素瘤HTB-72 細胞增殖，并誘導其凋亡[24]。本研究結果顯示，不同濃度的IL-32α 可抑制KYSE450 細胞增殖，遷移和侵襲，且呈劑量依賴性,為食管癌的靶向治療提供了一定的新思路，但其作用機制有待深入研究。

miRNA 廣泛存在于真核生物體內，與腫瘤的發生和發展密切相關。本研究結果顯示，過表達miR-216b-5p 抑制了 KYSE450 細胞增殖、 遷移和侵襲，說明miR-216b-5p 參與食管癌的發生和發展，上調其表達可延緩食管癌發展進程。為了探究IL-32α 抑制食管癌細胞增殖、 遷移和侵襲的作用機制,本研究檢測了IL-32α 對食管癌細胞中miR-216b-5p 水表達的影響，結果顯示，IL-32α 可促進KYSE450 細胞中miR-216b-5p 的表達，提示 IL-32α 可能通過上調 miR-216b-5p 表達抑制KYSE450 細胞增殖、遷移和侵襲。

miRNA 可與其靶 mRNA 的 3’UTR 結合，抑制靶mRNA 翻譯或降解靶mRNA,通過調控靶基因表達發揮生物學作用。在線靶基因預測軟件預測顯示,AKR1B10 可能是miR-216b-5p 的靶基因。本研究利用雙熒光素酶報告基因實驗證實了miR-216b-5p 可與 AKR1B10 的 3’UTR 靶向結合。同時,上調miR-216b-5p 表達抑制了AKR1B10 蛋白的表達, 而下調miR-216b-5p 表達促進了AKR1 B10 蛋白的表達,進一步說明了miR-216b-5p 靶向負調控AKR1B10 表達。AKR1B10 參與多種腫瘤的發生和發展, 如沉默AKR1B10 表達可能通過FAK/Src/Rac1 信號通路抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲[25]，miR-383-5p 通過靶向調控 AKR1B10 表達阻滯肝癌細胞的細胞周期進程，抑制細胞生長[26]。本研究結果顯示，抑制AKR1B10 表達抑制了食管癌KYSE450 細胞的增殖、遷移和侵襲能力，與相關研究報道結果一致[27]。研究還顯示，IL-32α 可抑制KYSE450 細胞中AKR1B10 的表達，而抑制miR-216b-5p 表達逆轉了 IL-32α 對食管癌 KYSE450細胞增殖、遷移和侵襲的影響，提示IL-32α 可能通過上調KYSE450 細胞中miR-216b-5p 表達，進而靶向負調控AKR1B10 表達抑制KYSE450 細胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，IL-32α 是一種可抑制食管癌細胞KYSE450 的增殖、遷移和侵襲的炎性細胞因子，其可能通過調控細胞中miR-216b-5p/AKR1B10 軸發揮作用。