NSCLC患者腫瘤組織中EGFR和K-Ras基因各亞型的突變情況及意義

李東

（河南省鶴壁市鶴煤總醫(yī)院，河南 鶴壁 458000）

流行病學研究證實,我國部分地區(qū)非小細胞肺癌（NSCLC）的發(fā)病率可達 273-482/10 萬人左右[1]。臨床上NSCLC 的發(fā)生, 能夠?qū)е禄颊邿o進展生存期或者無瘤生存期的縮短,導致患者臨床預后的惡化[2]。

在探討NSCLC 靶向藥物治療結(jié)局的過程中可以發(fā)現(xiàn)不同位點的基因突變的發(fā)生,能夠影響受體的空間結(jié)構(gòu)，導致分子靶向藥物治療結(jié)局的改變。血管內(nèi)皮生長因子（EFGR）上外顯子18、19 位點的突變，能夠?qū)е缕渥陨砣姿峤Y(jié)構(gòu)的改變，導致EGFR 受體結(jié)合能力的上調(diào)，提高了免疫靶向治療的效果，有助于提高治療的敏感性[3]；EGFR 外顯子20 位點的突變，能夠改變ATP 結(jié)合酶的活性，導致癌細胞攝取分子靶向性藥物的能力不足，使得癌細胞對于表皮生長因子絡氨酸激酶抑制劑的抵抗性明顯的增強[4]；K-Ras 基因的突變能夠?qū)е孪掠蜧TP 酶結(jié)合能力的改變, 影響腫瘤信號通路的激活，提高了肺癌上皮細胞的增殖能力，進而影響肺癌的免疫靶向治療效果[5]。為了揭示NSCLC 患者中EGFR 和K-Ras 基因的突變情況,從而指導臨床上肺癌患者的免疫靶向性治療, 本次研究選取2015 年 2 月-2018 年 1 月在我院治療的 NSCLC患者110 例,探討了EGFR 和K-Ras 基因的突變情況，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取 2015 年 2 月-2018 年 1 月在我院治療的NSCLC 患者110 例，其中男性67 例，女性 43 例；年齡 32～81 歲，平均年齡 52 歲；腺癌83 例，非腺癌27 例。納入標準：⑴均經(jīng)病理學確診；⑵臨床病理資料保存完整；⑶術(shù)前未行放化療等治療；⑷患者及家屬知情同意。排除標準：合并有其他惡性腫瘤者。

1.2 實驗方法 采用組織研磨法獲得上皮細胞，加入細胞裂解液TRIZOL，10000r/min 離心取清液，每1ml 的TRIZOL 試劑裂解的樣品中加入0.2ml 的氯仿，4 攝氏度冰上采用無酶的RNA 沖洗液進行洗滌，10000r/min 離心 5min，得到 RNA。加入逆轉(zhuǎn)錄酶后，37℃孵育 60min 生成 cDNA。進 PCR 產(chǎn)物擴增, 反應設置為：93℃ 2min、93℃ 1min、55℃ 2min，共 40 個 RT-PCR 循環(huán)。

采用南京博奧生物檢測公司生產(chǎn)的mtltipical檢測試劑盒, 在相應的位點進行單堿基的序列檢測。使用ABI1310 進行PCR 跑膠電泳，儀器購自美國 Life Technologies 公司, 采用 GENEMAPPER 軟件進行對比分析，儀器購自美國Life Technologies公司。

1.3 統(tǒng)計學處理 統(tǒng)計分析采用SPSS19.0 軟件，計數(shù)資料比較使用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR 基因突變情況 110 例患者中共檢測到37 例 EGFR 基因突變（33.64%），其中外顯子 18、19 和 20 突變分別占為 27.03%、32.43%、16.22%，外顯子18 和20 共同突變占13.51%，外顯子19 和20 共同突變占10.81%，見表1。

表1 EGFR基因突變情況

2.2 KRAS 基因突變情況 110 例患者中共檢測到3 例KRSA 基因突變（2.73%），其中外顯子 2 G12C突變 1 例，G12A 突變 1 例，外顯子 3 Q61H 突變 1例。未檢測到EGFR 與KRAS 基因雙重突變。

2.3 EGFR 和KRAS 基因突變與臨床病理特征關(guān)系 女性患者EGFR 基因突變率明顯高于男性患者（P＜0.05）；腺癌患者 EGFR 基因突變率明顯高于非腺癌患者 （P＜0.05）；KRAS 基因突變與患者年齡、性別、吸煙史、病灶大體類型、腫瘤直徑、TNM分期、分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（P＞0.05）。見表2。

3 討論

多種病理性因素的進展,均能夠促進肺泡上皮細胞的異常分裂，導致NSCLC 的發(fā)生率的上升。特別是在合并有長期吸煙病史的人群中，NSCLC 的發(fā)病率可進一步的上升[6]。NSCLC 的發(fā)生能夠?qū)е禄颊呖傮w生存時間的下降，影響患者的5 年或者3年生存率[7,8]。臨床靶向性治療在NSCLC 的整體治療過程中發(fā)揮了重要的作用,其能夠結(jié)合靶向性受體，抑制癌細胞的增殖或者擴增,降低癌細胞DNA的復制速度。但一項囊括了109 例樣本量的NSC LC 患者的表皮生長因子絡氨酸激酶抑制劑治療分析可見, 表皮生長因子絡氨酸激酶抑制劑治療后，18%左右的患者存在不同程度的耐藥，同時認為免疫靶向治療結(jié)局與NSCLC 患者的EGFR 外顯子的基因突變密切相關(guān)[9]。而本次研究對于NSCLC 患者體內(nèi)EGFR 外顯子不同位點或者K-Ras 基因突變的分析研究, 不僅能夠揭示NSCLC 患者的病情進展機制, 同時還能夠為臨床上NSCLC 患者的免疫靶向治療提供指導。

病理性因素如射線、化學性毒素等，均能夠促進基因突變的發(fā)生，增加堿基替換或者缺失的風險。EGFR 位點的突變主要位于細胞內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄區(qū)域的外顯子上，常見的EGFR 外顯子的突變包括10~20 種,而其中 18、19、20 及 21 是最為常見的相關(guān)突變類型[10]；K-Ras 基因與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，K-Ras 基因的突變主要為點突變和位移突變,相關(guān)的突變位點的改變能夠通過影響到GTP酶的結(jié)合狀態(tài),進而導致癌細胞內(nèi)的信號通路的激活, 并影響癌細胞對于靶向性治療藥物的抵抗性[11]。

本次研究首先探討了EGFR 基因突變的情況,發(fā)現(xiàn)EGFR 基因突變類型主要為外顯子18、19、20位點，這與湯雪璐等[12]研究者報道的相關(guān)EGFR 外顯子突變位點的結(jié)論較為一致，湯雪璐等[12]研究者認為，在 NSCLC 患者中，EGFR 外顯子 18、19 位點突變的比例可分別達18.5%、20.5%左右。對于外顯子18、19 位點突變的患者，可以采用針對EGFR的免疫靶向性藥物治療，其治療的敏感性較高，而對于外顯子20 位點突變或者18、20 位點聯(lián)合突變的NSCLC 患者, 免疫靶向性治療的耐藥風險較高,臨床上應該聯(lián)合采用其他的綜合性治療方式改善NSCLC 的臨床結(jié)局。對于K-Ras 基因的分析研究顯示，其突變的比例較低不足3%，而其主要的突變類型為G12C 突變、G12A 突變或者外顯子突變，提示了G12 等位點突變對于NSCLC 的影響。通過匯集不同的相關(guān)文獻，筆者認為這主要由于G12 位點突變的下列幾個方面的作用有關(guān)[13-15]：⑴G12C 或者G12A 突變，能夠?qū)е掳┘毎麅?nèi)GTP 依賴性蛋白激酶的激活，增加了三磷酸腺苷的激活程度，導致癌細胞的增殖和擴散風險的上升；⑵KRas 基因外顯子突變，能夠通過影響到癌細胞的核轉(zhuǎn)錄基因的活性，進而改變癌細胞的自我擴增的干細胞特性，導致NSCLC 患者臨床結(jié)局的改變。對于不同基因的突變與肺癌患者臨床特征的關(guān)系研究可見，KRAS 基因突變與NSCLC 患者的臨床特征并無明顯的關(guān)系，提示KRAS 基因具有較高的保守性，其進化過程中的基因穩(wěn)定性更高；而在女性患者或者肺腺癌患者中，EGFR 基因突變率明顯的上升，高于男性組或者其他類型肺癌組，差異較為明顯,提示了性別因素和腺癌耐藥的惡性腫瘤對于EGFR 基因的影響,這可能與女性患者體內(nèi)性激素的影響或者腺體細胞的EGFR 基因的保守程度較低有關(guān)，但具體的機制仍然需要深入研究。

表2 EFGR和KRAS基因突變與臨床病理特征關(guān)系

綜上所述，NSCLC 患者腫瘤組織中EGFR 突變率較高，而KRAS 基因突變率較低，其中EGFR突變與患者性別、病理類型有關(guān)。