污泥中氟喹諾酮類微污染物的測定方法研究

王 洋,楊雪玲,易 玲,丁小雙,鐘 懿,于 潔,王 侃*,莫春陽

（1.寧波大學 土木與環境工程學院,浙江 寧波 315211;2.寧波中科檢測技術服務有限公司,浙江 寧波 315105;3.三門峽市春和建材有限公司,河南 三門峽 472135）

醫藥類污染物是近年來出現的一類“新興污染物”,其主要來源于醫藥品的大量生產和使用.中國已成為最大的原料藥生產國,且對藥物的消耗速率驚人[1].近年來,各種醫藥品不斷在地表水、地下水、飲用水、土壤和動植物體內檢出,這些物質廣泛存在,持久性較強,對生態環境具有較大的潛在危害[2-3].醫藥類污染物對生態環境和人體的影響主要體現在抗生素抗性、內分泌干擾和生態毒性等方面,其產生作用的質量濃度可低至ng·L-1[4].抗生素類藥物進入環境后,會引起細菌的抗性,進而導致人類的致病菌產生抗性[5].一些醫藥類污染物會導致生物體的內分泌系統失衡,如干擾細胞的酶活性,改變血細胞吞噬作用,影響細胞粘附作用以及脂質過氧化作用等[6].同時,土壤中的一些醫藥類污染物會被植物吸收和積累,并對植物生長產生不利影響[2,7].

氟喹諾酮(Fluoroquinolones,FQs)是一類廣譜抗生素醫藥品,近年來生產量和使用量快速增加,目前占全球抗生素市場份額的15.3%.FQs 的大量使用導致其在環境中的檢出頻率和檢出濃度不斷升高.市政污水處理廠是FQs 進入環境的重要點源[8].在世界各地污水處理廠中,已檢出大量高濃度FQs[8-10].在我國污水處理廠進水和出水中,已檢出氧氟沙星(Ofloxacin,OFL)的質量濃度達368～3 675 ng·L-1和 165～1 561 ng·L-1,諾氟沙星(Norfloxacin,NOR)的質量濃度達263～2 746 ng·L-1和85～1162 ng·L-1,環丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)的質量濃度達268 ng·L-1和199 ng·L-1[11-12].這些污染物會隨污水廠出水進入地表水體,產生較大的生態毒性風險,如影響水生動物肝細胞的氧化代謝,導致氧化損傷;誘導水體產生FQs 抗性細菌等,產生作用的質量濃度可低至ng·L-1～μg·L-1[13].同時,FQs 由水體遷移至土壤中后,在ng·g-1的質量濃度下即可影響土壤微生物群落結構,且會在植物中富集,并通過食物鏈進入人體[14].

在污水處理流程中,活性污泥的吸附作用是FQs 從污水中去除的主要機制(FQs 較難生物降解),這導致污泥中累積了種類繁多、質量濃度很高的FQs,如3 450～24 760 ng·g-1DS(干固體)OFL、240～5 280 ng·g-1DS NOR、6 858 ng·g-1DS CIP[3,15-17].然而,污泥基質的復雜性導致污泥中FQs 的檢測流程復雜且回收率較低.目前主要采用超聲、微波或加壓溶劑等提取方法結合固相萃取、液相色譜質譜聯用儀等分析檢測污泥中的FQs,其中涉及到的操作參數及變量較多,如提取溶劑種類及濃度、固相萃取方法、色譜操作條件等,且液相色譜質譜聯用儀分析成本高昂.因此,需對檢測流程和操作參數進行優化,探索準確、高效且成本較低的污泥中FQs 的分析檢測方法[18-19].

OFL、NOR、CIP 是污泥中檢出頻率和檢出濃度最高的3 種FQs,本文通過優化污泥中FQs 的提取方法、固相萃取方法、液相色譜參數等,得到一種能夠同時檢測污泥中OFL、NOR、CIP 的方法,可為研究污泥中FQs 的遷移轉化及降解去除提供基礎和支撐[3,15-16].

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所使用的污泥采自寧波市江東北區污水處理廠.該污水處理廠污水處理工程采用A2O 工藝,日處理能力10 萬t.污泥取自二沉池,采回實驗室后經24 目篩除去懸浮物及固體雜質后,冷凍干燥并研磨,避光保存于干燥器中.除特殊說明,文中所用的溶劑均為色譜級.

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制

分別稱取2.5 mg OFL、NOR、CIP 標準品(中檢所),采用2 mL 0.1 mol·L-1鹽酸溶解,甲醇定容于25 mL 棕色容量瓶中,即為100 mg·L-1標準貯備液,于4 ℃避光保存.

1.2.2 從污泥中提取FQs

取1 g 污泥,將OFL、NOR、CIP 標準貯備液稀釋為10 mg·L-1,取一定體積(0.2～1 mL)加入污泥中,震蕩10 min 后避光靜置24 h,保證OFL、NOR、CIP 在污泥中分配均勻.向加標和未加標的污泥中加入不同種類的提取溶劑,振蕩20 min 后超聲提取15 min,混合液在7 000 g 離心10 min,收集上清液.重復上述步驟,合并上清液,隨后稀釋至一定體積.

提取溶劑包括:(a) 20 mL 乙腈-水溶液(25:75,氨水調pH=10);(b) 4 mL 50%硝酸鎂-氨水溶液(96:4);(c) 0.1 g EDTA-Na2,15 mL 乙腈-0.1 M EDTA-Mcllvaine 溶液(1:1);(d) 0.1 g EDTA-Na2,10 mL 磷酸鹽溶液-乙腈混合液(1:1,pH=3).

1.2.3 固相萃取

采用Waters Oasis HLB 固相萃取小柱(500 mg,6 mL)進行固相萃取,萃取流程包括活化、進樣、淋洗、洗脫4 個步驟[20].設置8 組固相萃取流程(A～H),見表1.收集的洗脫液采用氮吹或旋轉蒸發進行濃縮,處理溫度40～50 ℃,干燥后溶解于21.5%甲醇溶液,經0.22 μm有機膜過濾,用于液相色譜分析.

表1 不同固相萃取流程

1.2.4 液相色譜測定

采用配有熒光檢測器的液相色譜儀(島津,日本)進行FQs 質量濃度檢測,選用Luna 5u C8 色譜柱(250×4.6 mm,菲羅門,美國)和Inertsil ODS-SP C18 色譜柱(5 μm,250×4.6 mm,島津,日本),進樣體積10 μL,流速1 mL·min-1,激發、發射波長278、445 nm,流動相為甲醇/水溶液,等度或梯度洗脫.梯度洗脫條件設置為:15%甲醇經7.9 min 變為21.5%甲醇,再經過10.8 min 達到30%,并保持10 min.

回收率為樣品的色譜峰面積與標準溶液色譜峰面積的比值.

2 結果與討論

2.1 固相萃取流程優化

固相萃取用于凈化污泥提取液,是影響后續液相色譜檢測和分析的重要環節[19].選用表1 所示的8 種不同固相萃取方法(A～H),對1 mg·L-1的OFL、NOR、CIP 標準溶液進行固相萃取,回收率如圖1 所示.方法E 得到的回收率最高,OFL 的回收率為75.6%,NOR 的回收率為68.3%,CIP 的回收率為66.4%;其次依次為方法C、H、A、B、F,對應的回收率分別為56.3%～64.3%、54.3%～56.4%、25.1%～30.8%、8.9%～10.1%、0.8%～4.0%;方法D和G 對OFL、NOR、CIP 基本無回收.可見,最佳的固相萃取流程為方法E:6 mL 甲醇、6 mL 水(pH=3)活化HLB 固相萃取柱,200 mL pH=3 的樣品上樣,后用10 mL 水(pH=3)淋洗,6 mL 甲醇、6 mL含2%氨水的甲醇洗脫.

圖1 不同萃取方法對OFL、NOR、CIP 回收率的影響

2.2 濃縮方法優化

氮吹和旋蒸是常用的有機溶劑濃縮方法.將不同質量濃度的OFL、NOR、CIP 標準溶液進行氮吹或旋蒸濃縮后,樣品的回收率如圖2 所示.氮吹或旋蒸濃縮均可得到較高的回收率,樣品經氮吹后,回收率在81.4%～99.6%之間,經旋蒸后,回收率為92.3%～125.4%.同一濃縮方法對相同質量濃度的OFL、NOR、CIP 標準溶液的回收率基本一致,波動在±7%以內.但不同濃縮方法對樣品的回收率有一定影響,旋蒸濃縮后樣品的回收率整體高于氮吹濃縮,但旋蒸濃縮后部分樣品回收率大于100%,故選擇氮吹濃縮用于污泥中FQs 的提取純化,這也與文獻[19]中的濃縮方法一致.

圖2 氮吹和旋蒸濃縮對不同質量濃度OFL、NOR、CIP回收率的影響

2.3 提取溶劑優化

不同提取溶劑(a、b、c、d)對于污泥中OFL、NOR、CIP 回收率的影響如圖3 所示.

圖3 不同提取溶劑對OFL、NOR、CIP 回收率的影響

溶劑d 對污泥中FQs 的提取效率最高,OFL、NOR、CIP 的回收率分別為53.4%、50.1%、48.1%.其次為溶劑c,可分別得到31.9%、31.5%、35.6%的回收率.溶劑a、b 對污泥中FQs 的提取效率較低,除了OFL在溶劑b提取時得到41.0%的回收率,其余回收率均低于20%.因此,優選溶劑d:0.1 g EDTA-Na2、10 mL 磷酸鹽溶液-乙腈混合液(1:1,pH=3)進行污泥中OFL、NOR、CIP 的提取.

2.4 色譜條件優化

圖4 OFL、NOR、CIP 混合溶液經色譜柱分離后的液相色譜

C8 和C18 色譜柱是在分析極性污染物過程中常用的兩類反相色譜柱,其類型直接影響了樣品的保留時間和選擇性.以21.5%和25%甲醇為流動相對OFL、NOR、CIP 混合溶液進行等度洗脫,比較兩種色譜柱對于目標化合物的分離效果,結果如圖4 所示.C8 色譜柱無法有效分離OFL、NOR、CIP,3 種物質的色譜峰均出現重疊.而使用C18 色譜柱時,OFL、NOR、CIP 的色譜峰得到了有效分離,具有較好的分離效果和靈敏度,故優選C18 色譜柱用于液相色譜檢測.

在對污泥提取液進行液相色譜分析時,干擾物質的存在導致色譜峰對OFL、NOR、CIP 的分離度遠低于標準混合液的分離度.因梯度洗脫的分離效果通常優于等度洗脫,故采用梯度洗脫對污泥提取液中OFL、NOR、CIP 進行分離,梯度條件:15%甲醇經7.9 min 變為21.5%甲醇,再經過10.8 min達到30%,并保持10 min,結果如圖5 所示.在污泥提取液的色譜圖中,OFL、NOR、CIP 的色譜峰附近檢測出一些雜峰,這說明在污泥樣品的提取過程中,一些與OFL、NOR、CIP 性質接近的有機物也被提取出來.同時,OFL、NOR、CIP 的色譜峰與雜峰得到了有效的分離,這說明優化后的色譜條件能夠滿足污泥中OFL、NOR、CIP 的同時分析檢測.

圖5 OFL、NOR、CIP 混合溶液和污泥提取液經梯度洗脫后的液相色譜

綜上,污泥中FQs 的提取和測定流程優化為:采用0.1 g EDTA-Na2、10 mL 磷酸鹽溶液-乙腈混合液(1:1,pH=3)進行污泥中OFL、NOR、CIP 的提取,提取液經固相萃取進行凈化,凈化流程為6 mL 甲醇、6 mL 水(pH=3)活化HLB 固相萃取柱、200 mL pH=3 的提取液上樣,后用10 mL 水(pH=3)淋洗,6 mL 甲醇、6 mL 含2%氨水的甲醇洗脫,洗脫液經氮吹濃縮后用于液相色譜測定;液相色譜配備C18 色譜柱,流動相為甲醇/水,流動相梯度為15%甲醇經7.9 min 變為21.5%甲醇,再經過10.8 min 達到30%,并保持10 min.

2.5 定量范圍

將OFL、NOR、CIP 的標準溶液(質量濃度10～500 μg·L-1)進行液相色譜測定,繪制標準曲線,結果表明在測定的濃度范圍內標準曲線線性關系良好,相關系數均高于0.99.采用10倍信噪比計算定量限,可得其值為66.7 ng·g-1DS,可滿足一般污泥中OFL、NOR、CIP 的測定要求.

3 結論

通過對提取溶劑、固相萃取流程、濃縮方法、色譜條件等進行優化,得到了較優的污泥中OFL、NOR、CIP 的提取和測定方法:采用EDTA-Na2、磷酸鹽溶液-乙腈混合液對污泥進行超聲提取,HLB 固相萃取柱分離凈化,甲醇和堿性甲醇洗脫,氮吹濃縮,液相色譜(C18 色譜柱和梯度洗脫)測定.該方法能夠同時檢測污泥中的OFL、NOR、CIP,具有較高的分離度和回收率.