幽門螺桿菌感染小鼠模型的應用進展

朱 媚,馬郁荃,谷海瀛,2*

（1.寧波大學 醫學院,浙江 寧波 315211;2.寧波大學醫學院附屬醫院,浙江 寧波 315020）

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是一種持續定植于胃腸黏膜有鞭毛的革蘭陰性微需氧致病菌[1].H.pylori感染是慢性胃炎、消化性潰瘍的主要致病因素,并且與胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤、胃癌的發生密切相關.H.pylori感染也可能與缺鐵性貧血(IDA)、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、阿爾茨海默病(AD)等胃腸外疾病有關[2-3].H.pylori感染非常普遍,全球總感染率為44.3%,發展中國家明顯高于發達國家[4].H.pylori致病機制探索、新型治療藥物篩選和疫苗制備都需要建立合適的動物感染模型.

悉生乳豬是最早成功制備H.pylori感染的動物模型,H.pylori感染的悉生乳豬只出現了淋巴細胞性胃炎,但沒有出現胃潰瘍或胃癌等其他典型病變[5].由于乳豬實驗觀察時間比較短,因此無法研究其慢性感染[6].H.pylori感染的恒河猴會出現萎縮性胃炎,但沒有發展為消化性潰瘍或胃癌等病變[7].研究人員可以使用胃鏡連續觀察恒河猴胃部病變[6],但實驗觀察周期較長.悉生乳豬和恒河猴的飼養條件復雜,價格昂貴,因此都難以推廣.H.pylori感染的豚鼠只出現了慢性胃竇炎,沒有發生萎縮性胃炎、消化性潰瘍和胃癌等病變[8],因此豚鼠僅適用于建立H.pylori感染的胃炎模型.H.pylori感染的蒙古沙鼠會出現萎縮性胃炎、胃潰瘍、腸上皮化生以及胃腺癌等疾病[9],但目前缺乏生產轉基因沙鼠的方法,因此研究H.pylori感染過程中宿主沙鼠的作用受到了限制[10].盡管小鼠不是H.pylori感染的最適動物模型,但小鼠是研究H.pylori致病性使用最廣泛的動物宿主[10].小鼠遺傳背景明確、品系豐富、繁殖周期短、飼養方便、價格便宜,小鼠相關的實驗試劑也較多,并且基因工程小鼠在不斷增加,因此小鼠仍然是研究H.pylori的主要動物模型[9].

1 H.pylori 感染消化系統疾病的小鼠模型

早期研究表明H.pylori感染宿主的范圍有限,臨床分離菌株不易定植于小鼠胃黏膜.1997 年Lee等[11]首次使用H.pylori悉尼菌株(Sydney Strain,SS1)成功建立了小鼠感染模型,組織病理學和培養結果顯示該菌株在C57BL/6 小鼠胃部有較好定植載量.野生型小鼠可用來制備H.pylori感染胃炎模型,還可用于測試不同H.pylori突變株的定植特性[10].在不使用基因工程小鼠或化學致癌物的情況下,單獨的H.pylori感染野生型小鼠不會誘發胃癌[12].基因敲除和轉基因小鼠模型還可用來制備H.pylori感染的腸上皮化生、異型增生或胃癌等模型,并可用于評估特定宿主基因在H.pylori定植感染和胃癌進展中的作用.H.pylori感染消化系統疾病小鼠模型的制備方法和結果參照表1.

1.1 活動性胃炎和萎縮性胃炎

Lee 等[11]使用H.pyloriSS1 感染不同品系的小鼠,發現菌株在C57BL/6 小鼠體內表現出現較高的定植水平.感染3.5 個月時的C57BL/6 小鼠胃竇和胃體出現了輕度胃炎,感染6 個月時的胃炎明顯加重,感染8 個月時小鼠出現了慢性活動性胃炎以及胃體黏膜萎縮變化.Kim 等[13]使用H.pyloriSS1感染C57BL/6 小鼠,感染8 周時的小鼠胃底和胃竇固有層和黏膜下層均可見炎性細胞浸潤;感染16周和24 周時的胃黏膜中單核細胞增多,胃底可見腺體萎縮;感染36 周時的小鼠胃壁增厚,黏膜折疊肥大;感染50 周時的胃黏膜增生達到峰值,胃腺損失更加明顯;感染80 周時的胃竇出現了增生性胃炎,而胃體和胃底出現了萎縮性胃炎,但未觀察到胃潰瘍或胃癌.

1.2 化生、異型增生和胃癌

Kuzushita 等[14]使用H.pyloriSS1 感染p27?/?C57BL/6 小鼠模型,感染30 周和45 周時的小鼠胃部腸上皮化生發生率是40%(4/10)和67%(4/6),感染60 周時,58%(7/12)小鼠出現異型增生和胃腺癌,其胃部炎癥和病變進程與人類腸型胃癌相似,而SS1 感染的野生型小鼠沒有出現胃癌.他們認為p27 缺失和H.pylori定植是導致該模型形成胃癌的必要因素.該小鼠模型可用于H.pylori感染相關腸上皮化生、異型增生和胃癌的研究.Fox 等[15]使用H.pyloriSS1 感染TFF2?/?C57BL/6×Sv129 小鼠,感染6 個月和19 個月時的小鼠胃黏膜IFN-γ 水平顯著提高,小鼠胃竇出現了嚴重的異型增生.他們認為H.pylori感染過程中,TFF2 可能通過調節IFN-γ 水平來保護胃黏膜和抑制炎癥.該實驗為研究H.pylori感染的異型增生提供了很好的模型[16].Nam 等[17]先給iNOS?/?C57BL/6 小鼠和野生型C57BL/6 小鼠服用N-甲基-N-亞硝基脲(MNU),再使用H.pyloriSS1 感染小鼠,實驗結果顯示iNOS缺乏型小鼠的胃腫瘤發生率是31.0% (9/29),而野生型小鼠是72.7% (16/22).他們還發現iNOS 缺乏能引起NO 水平下降,有助于降低H.pylori相關胃癌的發生.

2 H.pylori 感染非消化系統疾病的小鼠模型

動物模型也是研究H.pylori感染對非消化系統疾病疾影響的重要工具,目前已經用于研究H.pylori非消化系統的小鼠模型見表2.H.pylori感染還被報道可能與慢性蕁麻疹、帽狀息肉病、帕金森病、動脈粥樣硬化和腦卒中等呈正相關,與哮喘、肥胖等疾病呈負相關,但這些相關的因果關系尚未證實[2-3],能否通過小鼠模型來證實H.pylori感染與這些疾病的關系有待研究.

表1 H.pylori 感染小鼠模型的制備方法和結果(消化系統疾病)

表2 H.pylori 感染小鼠模型(非消化系統疾病)

2.1 血液系統

H.pylori感染被認為可能與IDA和ITP發生有關[2].Fukuda 等[18]使用H.pyloriSS1 灌胃不同品系小鼠來研究H.pylori感染與ITP 的關系,發現BALB/c 小鼠感染后,血小板計數顯著減少.結果表明H.pylori感染與ITP 呈正相關,但H.pyloriSS1 感染的DBA/2 和C57BL/6 小鼠模型與ITP 發生沒有相關性.Burns 等[19]使用H.pyloriSS1 感染INS-GAS 小鼠模型,小鼠感染后的血紅蛋白和紅細胞計數減少,而紅細胞平均體積升高.結果表明小鼠出現的貧血是再生性貧血,而不是大多數缺鐵性貧血時典型的小細胞性、非再生性貧血,提示H.pylori慢性感染的INS-GAS 小鼠模型與IDA 沒有相關性.這些研究均提示H.pylori感染對胃腸外疾病的影響與模型動物宿主的選擇密切相關.

2.2 呼吸系統

近年來已有研究人員使用小鼠模型來探索H.pylori對肺部的影響.Arismendi 等[20]使用H.pyloriNCTC 11638 經氣管感染BALB/c 小鼠,小鼠感染后肺組織H.pylori培養陽性,感染7 d 時的肺泡出現中性粒細胞浸潤,感染14 d 時的炎性細胞侵潤加重并出現肺纖維化,感染30 d 時的肺組織嚴重纖維化進而影響到肺功能.實驗表明H.pylori感染導致肺組織形態學改變、炎性細胞增多和肺實質細胞退化,提示H.pylori感染與肺部炎癥呈正相關.Arismendi 等[21]使用同樣方法感染BALB/c 小鼠來評估H.pylori感染對肺部炎癥標志物表達的影響,小鼠感染后的肺水腫指數上升,支氣管肺泡灌洗上清液中活細胞百分比下降,而乳酸脫氫酶上升,小鼠肺組織染色可見典型H.pylori.實驗表明,H.pylori經氣管感染的小鼠出現肺部炎癥反應,提示H.pylori感染與肺部炎癥呈正相關.

2.3 神經系統

最近流行病學研究發現H.pylori感染可能與AD 發生有關[22],而生活條件或教育水平等因素與H.pylori感染和AD 都有關,這些共同的影響因素會導致流行病學研究結論具有局限性[23],因此有研究人員使用小鼠模型進行動物實驗來探索H.pylori感染與AD 的關系.Baudron 等[22]使用H.pyloriSS1 灌胃C57BL/6J 小鼠,小鼠感染18 個月的后腦內沒有出現淀粉樣斑塊和腦神經炎癥,并且腦內也檢測不到H.pyloriDNA.實驗結果表明H.pyloriSS1 感染的C57BL/6J 小鼠沒有發生AD,提示H.pylori感染與AD 發生沒有相關性.

3 探索H.pylori 生物被膜作用與宿主因素的小鼠模型

3.1 H.pylori 生物被膜作用

既往研究表明H.pylori致病性與細胞毒素相關蛋白A、空泡毒素A、脲酶、鞭毛、黏附素和外膜蛋白等毒力因子有關[10].新的研究和觀點認為生物被膜的形成在H.pylori定植過程中也扮演著重要角色[24],已有研究人員使用小鼠模型對H.pylori生物被膜形成進行初步探索.Attaran 等[25]使用胃炎患者分離株H.pylori19B和4B感染C57BL/6J 小鼠模型,利用抗H.pylori特異性免疫熒光抗體和掃描電子顯微鏡檢測小鼠胃部H.pylori的定植和生物被膜形成能力,發現小鼠感染后的胃黏膜出現了明顯的慢性炎性細胞浸潤,球性H.pylori嵌套在無定形基質中,牢固地附著在鱗狀上皮和腺上皮上,表明H.pylori能在小鼠胃的各個部位形成生物被膜.實驗證實C57BL/6J 小鼠體內H.pylori生物被膜的形成.但目前尚不清楚體內生物被膜基質是由細菌自己產生還是由宿主衍生,生物被膜是否為H.pylori提供了更有利的定植生態位也不明確,生物被膜在增加抗生素耐藥性和干擾免疫清除中的作用也不清楚[24],這些都需要更多的動物模型進一步研究.

3.2 H.pylori 感染的宿主小鼠因素

近年來,基因工程小鼠廣泛用于研究H.pylori感染過程中細菌與宿主因素的相互作用.Muthupalani 等[26]使用 Muc5ac?/?小鼠模型研究黏蛋白Muc5ac 在H.pylori感染中的作用,他們發現該小鼠模型傾向于在胃竇幽門區域自發性地出現上皮增生,而H.pylori感染可以減弱其胃體黏膜上皮化生.該研究表明Muc5ac 能維持胃竇上皮細胞平衡,并抑制H.pylori定植感染.Suarez 等[27]使用C57BL/6Nod1?/?和INS-GASNod1?/?小鼠模型來研究天然免疫受體NOD1 在H.pylori定植感染中的作用,他們發現Nod1的缺乏會導致H.pylori感染,引起更嚴重的炎癥和損傷,改變胃黏膜內趨化因子和細胞因子的表達組合,加速胃癌的發生.他們認為Nod1可能是通過改變巨噬細胞極化來發揮其限制作用,而Nod1的缺乏會有助于H.pylori逃避宿主免疫清除.Neumeyer 等[16]使用RNF43H292R/H295R小鼠模型研究H.pylori慢性感染在小鼠胃部病變進程中的作用,他們發現H.pylori感染加重了腫瘤抑制因子Rnf43突變小鼠的胃部病變,導致小鼠胃部CD44 表達增加,而NF-kB 信號過度激活.研究表明Rnf43突變與H.pylori引起的持續慢性炎癥共同促進了胃部惡性腫瘤的發生,他們推測H.pylori感染激活NF-kB 會進一步上調CD44 的表達,從而導致胃部病變向更嚴重的方向發展.

4 總結與展望

不同動物對H.pylori感染表現出不同的宿主反應和免疫應答,沒有任何一種動物感染模型能夠完全復制出H.pylori感染人類引起的所有病理結果.目前尚未見H.pylori感染導致小鼠出現胃潰瘍或十二指腸潰瘍的報道,能否開發出H.pylori感染小鼠的消化性潰瘍模型還不清楚.提高小鼠感染模型的穩定性和可復制性,使其在更短時間內更好地模擬人類感染后的病變還有待探索合適的實驗條件.