美洲大蠊提取物對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞HT22凋亡的影響

楊 麗，朱建華

（大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

人口老齡化是全世界共同面臨的一個(gè)難題，中國是世界第一人口大國，至2018年末，60周歲以上人口已達(dá)24 949萬人，占總?cè)丝诘?7.9%〔1〕。研究表明〔2-3〕，60歲以上老年人中40%存在認(rèn)知能力改變，開始表現(xiàn)為認(rèn)知能力下降，繼而產(chǎn)生多種老年性認(rèn)知缺陷和障礙性疾病，嚴(yán)重影響老年人的生活。因此，深入研究衰老發(fā)生的機(jī)制、開發(fā)抗衰老藥物一直是國內(nèi)外神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。

美洲大蠊（Periplaneta americana L.），俗名蟑螂，屬蜚蠊科大蠊屬昆蟲〔4〕。現(xiàn)代藥理研究顯示，美洲大蠊提取物具有促進(jìn)組織修復(fù)、抗腫瘤、改善血液循環(huán)、增強(qiáng)免疫、保護(hù)肝臟等作用〔5〕。以往的研究表明美洲大蠊提取物具有抗衰老作用，但其在抗神經(jīng)衰老方面的研究較少。海馬是記憶中樞，神經(jīng)系統(tǒng)衰老、認(rèn)知功能障礙與基底前腦及海馬的神經(jīng)元丟失有密切關(guān)系。有文獻(xiàn)報(bào)道〔6-7〕在衰老期，海馬齒狀回的神經(jīng)元發(fā)生減少，導(dǎo)致新生神經(jīng)元的數(shù)量下降，神經(jīng)元的損耗不能補(bǔ)充，最終導(dǎo)致了學(xué)習(xí)記憶能力的減退。因此，促進(jìn)神經(jīng)元增殖、抑制神經(jīng)元凋亡就成了抗神經(jīng)衰老藥物研究的兩大方向。美洲大蠊提取物的抗衰老作用是否與抑制海馬神經(jīng)元凋亡、減少海馬神經(jīng)元丟失有關(guān)未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究美洲大蠊不同提取物對(duì)小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系凋亡的影響，為探討美洲大蠊提取物抗衰老作用機(jī)制，進(jìn)一步擴(kuò)大美洲大蠊提取物在臨床上的應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 HT22細(xì)胞 小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22細(xì)胞（上海生物技術(shù)股份有限公司）。

1.2 藥物與試劑 美洲大蠊藥材用95%乙醇回流提取，經(jīng)減壓濃縮、石油醚脫脂、冷凍干燥后得美洲大蠊粗提物，再經(jīng)D101大孔樹脂吸附過夜，分別用水和不同濃度乙醇（40%、60%、95%）洗脫，得到美洲大蠊水提物、40%醇提物、60%醇提物和95%醇提物。上述提取物均由大理大學(xué)藥學(xué)院肖培云教授提供。使用時(shí)先用0.01%二甲基亞砜（DMSO）溶解，然后用改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）稀釋至相應(yīng)濃度。細(xì)胞凋亡試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：KJA108）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，杭州四季青生物工程材料有限公司，批號(hào)：11011-8611）；DMEM培養(yǎng)基（美國Corning公司，批號(hào)：10-013-CV）；0.25%胰蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：T1300）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS，美國Corning公司，批號(hào)：21-040-CV）；青鏈霉素混合溶液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：P1400）。

1.3 主要儀器 TS-100相差顯微鏡（日本Nikon公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國BINDER公司，型號(hào)：12-12299）；902超低溫冰箱（美國Thermo Fisher公司）；流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞接種于含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合溶液的DMEM培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞凋亡檢測 使用對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整到5×105個(gè)∕mL，接種于6孔板中，每孔加入0.5 mL細(xì)胞懸液。將細(xì)胞分為粗提物組、95%醇提物組、60%醇提物組、40%醇提物組和水提物組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行藥物干預(yù)，培養(yǎng)48 h后，1 500 r∕min離心5 min收集細(xì)胞，按細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，各組參數(shù)間的差異比較采用單因素方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)以（xˉ±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

與溶劑對(duì)照比較，經(jīng)100μg∕mL和120μg∕mL美洲大蠊粗提物處理的HT22細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.05）；各濃度美洲大蠊95%醇提物處理的HT22細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.05），且呈濃度依賴性。各濃度美洲大蠊60%醇提物處理對(duì)HT22細(xì)胞凋亡無顯著影響，與溶劑對(duì)照比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。經(jīng)100μg∕mL和120μg∕mL美洲大蠊40%醇提物及水提物處理的HT22細(xì)胞凋亡率顯著減少（P＜0.05）。濃度相同時(shí)美洲大蠊水提物的凋亡率最低。見表1、圖1。

表1 不同美洲大蠊提取物干預(yù)后對(duì)HT22細(xì)胞凋亡的影響（xˉ±s，n=3）

4 討論

海馬與學(xué)習(xí)記憶功能有著密切的聯(lián)系，對(duì)記憶起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。Simi?等〔8〕的研究表明正常老年人和阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）患者都有海馬神經(jīng)元丟失，但AD患者海馬神經(jīng)元丟失與正常老年人海馬神經(jīng)元丟失有所不同，存在區(qū)域選擇性，AD患者的神經(jīng)元數(shù)量減少僅在海馬下托和齒狀回。Kril等〔9〕的研究也提示AD患者海馬體積和神經(jīng)元含量隨著病程的延長而顯著下降。Kiray等〔10〕研究單胺氧化酶B抑制劑去甲腎上腺素對(duì)氧化應(yīng)激引起的空間記憶障礙和老年雄性大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元總數(shù)的影響，發(fā)現(xiàn)去甲腎上腺素能增強(qiáng)老年雄性大鼠的空間記憶能力，并提出這種增強(qiáng)可能與抑制脂質(zhì)過氧化物酶和減輕海馬中隨年齡增長的神經(jīng)元丟失有關(guān)。總之，海馬神經(jīng)元數(shù)量的減少與衰老密切相關(guān)，抑制海馬神經(jīng)元凋亡可延緩衰老的進(jìn)程，減輕衰老所致疾病的臨床表現(xiàn)。

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，美洲大蠊提取物對(duì)HT22細(xì)胞的凋亡是有影響的，但不同提取物有不同的表現(xiàn)。美洲大蠊粗提物及95%醇提物具有促進(jìn)HT22細(xì)胞凋亡的作用；而水提物及40%醇提物則有抑制HT22細(xì)胞凋亡的作用，抗凋亡作用隨著劑量增高而增強(qiáng)。抑制海馬神經(jīng)元的凋亡就可以從一定程度上保持海馬神經(jīng)元的數(shù)目，延緩中樞神經(jīng)系統(tǒng)的衰老，減輕各種因素對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力的影響。所以美洲大蠊水提物和40%醇提物可能對(duì)延緩衰老有一定的作用。

目前對(duì)美洲大蠊提取物藥理作用的研究主要集中在抗腫瘤、抗病毒、抗炎癥及促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)等方面，對(duì)其抗衰老的作用機(jī)制研究非常少。有研究顯示衰老小鼠認(rèn)知能力明顯遲鈍與海馬神經(jīng)元細(xì)胞減少相關(guān)，抗氧化藥物能提高海馬神經(jīng)元數(shù)量，改善衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力〔11〕。美洲大蠊提取物有較強(qiáng)的抗氧化作用〔12-13〕，可以減輕氧化應(yīng)激對(duì)神經(jīng)元造成的損害，從而減少神經(jīng)元的凋亡。吳建新等〔12〕研究了美洲大蠊提取物制劑心脈龍的抗衰老作用，發(fā)現(xiàn)衰老小鼠血清谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性明顯低于青年對(duì)照組，而心脈龍能顯著提高衰老小鼠血清谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性，還能明顯降低腦組織和肝臟脂褐質(zhì)含量及腦組織丙二醛含量，提示其在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)、外均有抗氧化作用。焦春香等〔14〕的研究也提示美洲大蠊提取物的抗衰老作用可能與其抗氧化、清除自由基的功能有關(guān)。因此，抗氧化和清除自由基可能是美洲大蠊提取物抗衰老的機(jī)制之一。炎癥是機(jī)體內(nèi)常見的病理過程，各種不同的原因都可以導(dǎo)致細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)，引起細(xì)胞的衰老。美洲大蠊提取物具有較強(qiáng)的抗炎作用，更能促進(jìn)組織增生與修復(fù)〔12，15〕，抗炎作用也可能是其抗凋亡作用的一個(gè)方面。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡圖

總之，美洲大蠊提取物能夠影響小鼠神經(jīng)元的凋亡過程，但不同提取物的作用是不同的。我們將用更多的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討美洲大蠊提取物抗衰老作用的可能機(jī)制。