營養鹽比例對硅藻水華優勢種小環藻生長和生理的影響

劉 鑫， 王 超， 王沛芳*， 王 洵， 馬晶潔， 胡 斌

1.河海大學環境學院， 江蘇 南京 210098

2.河海大學， 淺水湖泊綜合治理與資源開發教育部重點實驗室， 江蘇 南京 210098

硅藻是一類細胞壁高度硅質化的單細胞藻類，種類繁多、數量龐大，是水生態系統中重要的初級生產者[1]. 硅藻對水環境變化非常敏感[2]，其許多種類能很好地反映水體的營養狀態[3]. 硅藻水華的暴發與溫度、光照、營養鹽及緩慢的流速等密切相關[4]. 不同的生境中，硅藻水華的優勢種也有很大差異[5]. 已有研究發現，小環藻是河流、湖庫等生態系統中最為常見的硅藻水華優勢種.

近年來，隨著長江流域經濟的快速發展和周邊人口數量的增加，長江水系富營養化趨勢日益明顯，在河流、湖庫中多次暴發硅藻水華. 從1992年至今，漢江中下游及其支流已陸續報道了11次較為嚴重的早春硅藻水華[6]；三峽水庫的支流香溪河[7]、神農溪和大寧河[8]以及太湖流域的天目湖沙河水庫、宜興的橫山水庫[9]等也出現了不同程度的硅藻水華，對水生態系統和人類的健康造成了不利影響.

水體中過量的氮(N)、磷(P)是硅藻異常繁殖的物質基礎. 除氮、磷元素外，硅(Si)元素對硅藻生長亦具有關鍵性作用[10]，其不僅是硅藻細胞壁的重要組成成分，還參與硅藻細胞中光合色素、蛋白質和DNA的合成[11]，其濃度大小可直接影響硅藻的生物量[12]. 自然水體中硅主要源于陸地上硅質巖的風化作用，隨地表徑流匯入河口及沿海水域，人為活動供給較少[13]；而氮、磷濃度受人為活動影響較大，與生活污水排放、化肥農藥等不合理使用及人口密度等緊密相關[14]. 受人為因素影響，水體營養鹽濃度變化必然導致營養鹽結構發生改變. 現有研究多集中于N/P對水華藍藻優勢形成的影響，而對與硅藻生長相關的Si/P、Si/N等研究較少.

自三峽水庫蓄水后，長江口水域硅濃度顯著降低，氮、磷濃度不斷升高，致使水體營養鹽結構發生顯著變化(N/P上升，Si/P、Si/N下降)，最終導致硅藻生物量減少、浮游植物優勢種組成發生改變[15-16]，另在一定程度上還增強了非硅藻的競爭優勢[17]. 此外，漢江流域歷年發生硅藻水華致使水體硅酸鹽截留沉積，以及外源營養物質氮、磷等不斷輸入，促使一些河段Si/N較大，現有學者認為較高的Si/N是漢江流域硅藻水華暴發的主要原因之一[18]. 由此可見，研究Si/P和Si/N對硅藻生長的影響具有重要意義. 然而，現有研究多集中在野外采樣試驗的相關性分析方面，針對營養鹽結構變化下硅藻的生長及生理響應，以及營養鹽濃度變化改變營養鹽結構對硅藻的生長有何影響效果等方面的研究仍存在不足，且有關水體中何種營養鹽比例變化對硅藻生長影響最為顯著也暫無明確的定論. 為此，該文以長江流域水體中最為常見的硅藻水華優勢種——小環藻為研究對象，通過室內模擬試驗，探究不同氮、磷、硅營養鹽比例及其濃度對小環藻生長和生理的影響，分析營養鹽濃度變化下，小環藻生長所需的最適營養鹽比例及濃度，并定量分析得出對硅藻生長影響最為顯著的營養鹽比例，以期為揭示硅藻水華發生的營養鹽調控機制提供理論基礎，并為硅藻水華的防治提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗藻種

所用藻種為小環藻(Cyclotellasp. FACHB 1654)，購自中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫，采用D1[4]培養基保存培養，培養條件為溫度25 ℃，光照強度 2 500 lx，光暗比14 h∶10 h.

1.2 試驗方法

進行不同營養水平下N/P、Si/P、Si/N對小環藻生長和生理的影響試驗研究. 初始氮、磷、硅濃度的設定，參照長江流域水體中其相應濃度[19-21]，如表1所示，培養基中營養鹽初始濃度與設定值的偏差不超過10-3.

試驗所用培養基以HGZ[22]培養基為基礎，通過改變HGZ基礎培養基中硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硅酸鈉的添加量來控制各試驗組的初始氮、磷、硅的質量濃度. 培養液配制完成后，均于高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃下滅菌30 min，冷卻后待接種.

將D1培養基中處于對數生長期的小環藻藻種在 4 500 r/min下離心15 min，收集藻細胞，接種至滅菌過的未添加氮、磷、硅的HGZ培養基中，饑餓處理48 h. 隨后在250 mL錐形瓶中添加100 mL含不同濃度氮、磷、硅的培養基(見表1)，接種經饑餓處理的藻種. 初始接種濃度5×104cells/mL，每組設置3個重復. 接種后放置于溫度(25±1)℃、光照強度 3 000 lx、光暗比14 h∶10 h的光照培養箱中進行一次性培養，培養周期為14 d. 將接種日記為第0天，接種次日記為第1天，分別在第1、3、5、7、9、11、13天的同一時間測定藻細胞密度和葉綠素熒光參數. 培養期間，每天定時搖勻3次，防止藻細胞貼壁生長而影響試驗結果.

表1 試驗組N、P、Si濃度及N/P、Si/P、Si/N設定

1.3 測定指標和方法

藻細胞密度：取3 mL樣品，利用分光光度計測定小環藻懸液在680 nm處的吸光值，根據提前繪制好的小環藻藻細胞數與吸光值之間的標準曲線(Y=2.157 4X+0.006 8，R2=0.998 1)，計算藻細胞數.

葉綠素a濃度和葉綠素熒光參數：取1 mL藻液于測量杯中，暗適應5 min，在2 μmol/(m2·s)光強下測定最大光量子產量(Fv/Fm)；再于32 μmol/(m2s)光強下用浮游植物熒光儀(Phyto-PAM-Ⅱ, Hein Walz, Germany)測定葉綠素a濃度[23]. 隨后選擇Light Curve界面，測定藻液在不同光強下的相對電子傳遞效率，并對測量結果進行Eilers-Peeters模型[24]擬合，計算公式：

P=PAR/(a×PAR2+b×PAR+c)

(1)

α=1/c

(2)

(3)

(4)

式中：P為光合速率，μmol/(m2·s)(以光子數計，下同)；PAR為光強，μmol/(m2·s)；a、b、c為計算參數，根據擬合結果求得光能利用效率(α)，μmol/(m2·s)，反映生物體的光能利用效率；Ik為半飽和光強，μmol/(m2·s)，反映生物體對強光的耐受能力；ETRmax為最大相對電子傳遞速率，μmol/(m2·s)，反映生物體的光合活性高低.

比生長速率(μ)是指在某一時間間隔內藻類的生長速率，其計算公式：

μ=(lnN2-lnN1)/(T2-T1)

(5)

式中：N1為某一時間間隔開始時的藻細胞密度，cells/mL；N2為某一時間間隔終結時的藻細胞密度，cells/mL；T2-T1為時間間隔，d.

1.4 數據處理

采用Origin 9.0軟件進行圖形繪制；利用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)和Tukey多重比較，取P<0.05為顯著差異.

2 結果與分析

2.1 小環藻在不同N/P下的生長和葉綠素熒光參數變化

由圖1可見，隨著N/P的升高，小環藻的最大藻細胞密度呈上升趨勢，在N/P為30時，其生長情況最好；其中，N/P為20和30的高磷濃度組，小環藻生長差異不明顯，比生長速率分別為0.177 7、0.174 6 d-1(見表2). 整個試驗過程中，在同一N/P下增加氮、磷濃度，對小環藻的生長具有明顯的促進作用.

不同試驗組中葉綠素a濃度在培養期間均表現出先增加后減少的趨勢，最大值出現在第11天. 對于磷濃度相同的試驗組，提高N/P對葉綠素a的積累有促進作用. 各N/P下的低磷濃度組，葉綠素a濃度均處于較低水平. 整個試驗過程中，N/P為20和30的高磷濃度組的葉綠素a濃度較高且相近，分別為1 130.4 和 1 135.3 μg/L.

不同N/P下小環藻葉綠素熒光參數的變化情況如圖2所示. 由圖2可見，A1～C1七組，隨著培養時間的增加，Fv/Fm出現了不同程度的降低，下降范圍為0.26～0.32；而C2、C3處理組，Fv/Fm在前7 d內都維持在較高水平，7 d后才呈下降趨勢，且僅下降了0.13，低于前7組的下降程度. 這說明在N/P為20和30的高磷濃度下，小環藻光合效率也較高.

各N/P的低磷濃度組，小環藻α、Ik和ETRmax值均呈下降趨勢，試驗7 d后均處于較低水平. 中磷濃度組，α值在試驗前5 d能穩定在較高水平，之后呈大幅下降趨勢；其中，α、Ik和ETRmax值在N/P為30下最高. 而N/P為20、30的高磷濃度組，在整個培養過程中，α值一直穩定在較高水平，Ik和ETRmax值僅在試驗前7 d維持在較高水平.

圖1 不同N/P下各試驗組小環藻的藻細胞密度及葉綠素a濃度的變化

表2 不同N/P對各試驗組小環藻比生長速率(μ)的影響

圖2 不同N/P下各試驗組小環藻葉綠素熒光參數Fv/Fm、α、Ik、ETRmax的變化

2.2 小環藻在不同Si/P下的生長和葉綠素熒光參數變化

由圖3可見，提高Si/P對低、中磷濃度組中小環藻的生長及葉綠素a的積累具有明顯的促進作用. Si/P為20、50的低磷濃度組，小環藻生長最為緩慢，比生長速率僅為 0.086 3、0.107 0 d-1(見表3)，藻細胞密度、葉綠素a濃度均顯著低于其余7組，此時提高Si/P至100，藻細胞增殖速率明顯加快，葉綠素a濃度顯著增加，最大藻細胞密度值可達2.86×105cells/mL，是Si/P為20時的1.9倍. 整個試驗過程中，Si/P為50的高磷濃度組小環藻生長情況最好，最大藻細胞密度為7.29×105cells/mL，葉綠素a濃度為 1 444.4 μg/L；而Si/P為100的高磷濃度組，小環藻生長相對遲緩，生長情況次于Si/P為50的高磷試驗組.

不同Si/P下小環藻的葉綠素熒光參數的變化情況如圖4所示. 各試驗組Fv/Fm、α、Ik及ETRmax的變化規律相同，總體上呈先上升后下降的趨勢. 各試驗組Fv/Fm在前5 d呈上升趨勢，增加范圍為0.03～0.07，培養5 d后出現輕微減小，下降范圍僅為0.06～0.09. Si/P為20、50的低磷濃度組，α、Ik、ETRmax值均顯著低于其他7組(P<0.05). Si/P為50、100的中磷濃度組，Ik在3 d后略有下降，總體上穩定于較高水平，ETRmax變化差異不明顯，Ik、ETRmax值在Si/P為100時最高. 整個試驗過程中，Si/P為50的高磷濃度組，α、Ik、ETRmax值均顯著高于其余8組(P<0.05)，光合活性高.

圖3 不同Si/P下各試驗組小環藻的藻細胞密度及葉綠素a濃度的變化

表3 不同Si/P對各試驗組小環藻比生長速率(μ)的影響

2.3 小環藻在不同Si/N下的生長和葉綠素熒光參數變化

由圖5可見，Si/N的提高對小環藻的生長具有明顯的促進作用，在Si/N為5.0時，最有利于小環藻生長. 其中，Si/N為1.0、2.5的低氮濃度組，藻細胞密度增長最為緩慢，比生長速率分別為0.093 6、0.099 1 d-1(見表4)，在整個培養過程中藻細胞密度值、葉綠素a濃度均處于較低水平，葉綠素a濃度最大值分別為297.7、311.5 μg/L. Si/N為2.5、5.0的高氮濃度組，小環藻生長情況較好，但兩組間差異不明顯，藻細胞密度最大值分別可達6.29×105、6.31×105cells/mL，此外，在整個試驗周期內這兩組葉綠素a濃度也均一直處于增長階段，小環藻長勢較好.

不同Si/N下小環藻葉綠素熒光參數變化如圖6所示. 由圖6可見，Si/N為2.5、5.0的高氮濃度組，Fv/Fm、α值在培養前11 d均可維持在較高水平；而各Si/N的低氮濃度組，Fv/Fm、α值在培養5 d后便出現大幅下降，且各值顯著低于其余各組(P<0.05). 在整個試驗周期中，不同Si/N下，Ik、ETRmax均呈下降趨勢，隨著Si/N的增加，其降幅依次減小. 各Si/N的高氮濃度組，Ik、ETRmax顯著高于低、中氮濃度組(P<0.05). 其中，Si/N為2.5、5.0的高氮濃度組，Ik、ETRmax值降幅最小.

圖5 不同Si/N下各試驗組小環藻的藻細胞密度及葉綠素a濃度的變化

表4 不同Si/N對各試驗組小環藻比生長速率(μ)的影響

圖6 不同Si/N下各試驗組小環藻葉綠素熒光參數Fv/Fm、α、ETRmax、Ik的變化

3 討論

3.1 N/P對小環藻的生長和生理的影響

Redfield[25]于1958年提出藻類健康生長及生理平衡所需的最適N/P為16. 然而浮游藻類對營養元素的需求及利用特性存在差異，致使藻類生長的最適比例并不一定遵循這一規律. 該試驗結果顯示，小環藻生長最適N/P為30. 在試驗所設濃度范圍內，提高N/P可促進小環藻的生長. 在N/P為20、30的高磷濃度組，小環藻生長差異不明顯，這說明氮濃度為6 mg/L時已經達到小環藻生長的飽和濃度. 可見氮、磷濃度較充足時，營養鹽的絕對濃度比N/P對小環藻生長的影響更大. 整個培養過程中，小環藻在各N/P的低磷濃度組，生長最為緩慢，葉綠素a濃度及光合活性均處于較低水平，這一結果可能是因為磷缺乏，光合作用中的Calvin循環受到抑制，小環藻PSII反應中心受損，使得細胞分裂、葉綠素合成受阻，光合活性降低[26]. 如果以“Redfield”比(16∶1)為判斷標準，在N/P 為10～30范圍內，小環藻的生長應從氮限制轉為磷限制，而該試驗中小環藻生長一直受氮限制，這可能是由氮的絕對濃度低于限制小環藻生長的閾值所致[27]. 在漢江硅藻水華暴發期，水體TN/TP大于16，硅藻密度(Y)與TN/TP(X)之間呈指數型關系(Y=30.07e-0.221X，R2=0.628 1)[6]，該趨勢與筆者所得結果不同，可能是由水華期間水體處于磷限制狀態(TP濃度為0.05～0.19 mg/L)所致. 由此可見，在研究氮磷比值對硅藻生長的影響時，需加以考慮水體中氮磷實際濃度. 吳世凱等[28]研究表明，硅藻門的藻類在TN/TP為12～30的環境中有較好的生長潛力. 曾艷藝等[29]研究表明，條紋小環藻的最適N/P在22～25之間. 在筆者所設濃度下，小環藻生長最適N/P為30，與上述已有研究結果相近.

3.2 Si/P對小環藻的生長和生理的影響

劉霞[30]研究發現，硅、磷共限制的水體環境會抑制浮游硅藻的生長繁殖. 該試驗結果顯示，在中、低磷營養鹽濃度下，提高Si/P對小環藻的生長具有明顯的促進作用，Si/P為100時，最適宜小環藻生長；而在高磷營養鹽濃度條件下，Si/P為50時小環藻生長情況最佳，最大藻細胞密度達7.29×105cells/mL，繼續提高Si/P至100，小環藻生長變得遲緩，光合活性降低. 另外，Si/P為20、50的低濃度組(磷濃度為0.03 mg/L)，小環藻的藻細胞密度、葉綠素a濃度及葉綠素熒光參數值均顯著低于其余各組. 這說明硅、磷濃度分別低于0.03、1.5 mg/L時，能極大地限制小環藻的生長. 胡勝華等[31]對武漢月湖水體營養物質及硅藻密度的監測發現，月湖溶解性無機磷(DIP)、溶解性硅(DSi)平均質量濃度分別為0.077、3.70 mg/L，此時硅藻與DSi/DIP比值呈極顯著正相關，同時，DSi與DIP濃度的上升還可提高硅藻的生長速率. 該研究中在磷濃度低于0.1 mg/L、硅濃度低于10 mg/L條件下，Si/P對小環藻生長的影響結果進一步支持了胡勝華等[31]的結論. 然而在高磷濃度下，小環藻Si/P的最適生長比例為50，這可能是因為小環藻生長存在最適硅濃度，且在該研究中，小環藻在硅濃度為15 mg/L時生長最佳. 這與已有研究結果一致，例如，王珺等[32]發現，微小小環藻生長繁殖的最適硅濃度為25 mg/L，適宜濃度為10～30 mg/L. Shatwell等[33]研究表明，低溫、低DSi濃度的條件可增強硅藻的競爭優勢，且當硅濃度較低時，能更早地阻止春季硅藻的生長. 自然水體在正常情況下，硅濃度一般低于10 mg/L[18,34-35]，尚未超過小環藻生長的最適濃度，此時硅濃度的增加會進一步促進小環藻的生長，因此，在硅藻水華的防治過程中應加強水質硅濃度的監測.

3.3 Si/N對小環藻的生長和生理的影響

YE等[36]研究表明，Si/N為1.0可作為硅藻生長受限的重要標準，在Si/N大于1.0的水體中硅藻易于占據優勢地位. 在硅藻水華暴發期，硅是主要限制元素，當水體硅被耗盡后，氮元素將限制硅藻生長[35]. 該研究發現，Si/N升高對小環藻的生長具有顯著的促進作用，在試驗所設濃度范圍內，最適宜小環藻生長的Si/N為5.0. 在整個試驗過程中，Si/N為2.5、5.0的高氮濃度組，小環藻生長情況較好，光合活性高，但兩組小環藻生長差異不明顯，說明氮濃度為6 mg/L時，小環藻生長最適硅濃度為15 mg/L. 此外，Si/N為1.0、2.5的低氮濃度組，小環藻生長最為緩慢，葉綠素a濃度及葉綠素熒光參數值均處于較低水平. 這表明氮濃度低于0.6 mg/L、硅濃度低于1.5 mg/L時，可極大地限制硅藻生物量. 從目前天目湖治理經驗來看，全年水體總氮濃度低于1.0 mg/L、總磷濃度低于0.025 mg/L，能顯著降低硅藻水華發生風險[9]，此時，若能將硅濃度控制在1.5 mg/L以下，則可進一步抑制硅藻水華的暴發. 吳興華等[18]研究表明，漢江中下游干流硅藻水華發生期，水體氮濃度為1.24～1.67 mg/L，硅濃度為2.21～9.21 mg/L，硅藻水華細胞密度與水體中硅濃度、硅氮比均呈顯著正相關，認為較高的硅氮比是引發硅藻水華的主要原因之一. 該研究中，氮濃度低于2 mg/L、硅濃度低于10 mg/L時，Si/N對小環藻生長的影響結果可進一步支持吳興華等[18]的研究結論. 此外，水體Si/N以及硅濃度的降低還會在很大程度上造成硅藻種類及生物量的減少[15]. 可見，在較低的硅濃度及Si/N下，硅藻水華暴發的可能性較小.

對比不同營養鹽結構下小環藻的生長情況發現，Si/P對小環藻生長的影響最為顯著. 在試驗所設濃度內，小環藻Fv/Fm、α值在硅、磷共限制體系中僅出現輕微下降，試驗末期仍能維持在較高水平，而在氮磷、硅氮共限制條件下，試驗5 d后葉綠素熒光參數值便出現大幅下降；另外，Si/P為50的高磷濃度組，藻細胞密度值最高達7.29×105cells/mL，顯著高于其余各組. 可見，小環藻生長受Si/P的影響最大. 此外，從以上研究可以發現，即使在營養鹽結構不變的條件下，營養鹽濃度變化對小環藻生長亦有明顯的影響，因此，探究營養鹽結構對小環藻的生長影響需要結合營養鹽的絕對濃度來進行.

4 結論

a) 營養鹽比例對小環藻的生長有顯著影響，其中Si/P的影響最為明顯. 小環藻在N/P為30、Si/N為5.0的環境中具有較好的生長潛力. 在低、中營養水體中，小環藻生長潛能與Si/P呈正相關，最適Si/P為100；在高濃度水體中，最適Si/P為50.

b) 氮、磷濃度較高時(氮濃度不低于6 mg/L、磷濃度不低于0.1 mg/L)，硅是小環藻生長的主要限制因素，最適濃度為15 mg/L.

c) 磷濃度在0.03 mg/L以及氮濃度低于0.6 mg/L、硅濃度低于1.5 mg/L時，不利于小環藻的正常生長. 因此，實際水體營養鹽濃度若低于此水平，將能有效控制硅藻水華的暴發.