JX-594和紫杉醇雙層覆膜支架治療兔食管鱗癌實驗研究

方統(tǒng)磊， 肖鈞元， 張一然， 朱悅琦， 程英升

中晚期食管癌患者常伴發(fā)食管惡性梗阻，其中不可手術(shù)的食管癌患者5年生存率僅15%～25%［1］。載藥食管支架可迅速緩解食管梗阻癥狀，提高晚期食管癌患者生存質(zhì)量。藥物支架通過局部緩釋化療藥物抑制腫瘤細(xì)胞生長，減少系統(tǒng)性給藥引起的全身不良反應(yīng)，甚至減慢癌癥進(jìn)程，延長生存期。紫杉醇是許多侵襲性腫瘤包括食管癌在內(nèi)的一線化療藥，對食管鱗癌單藥有效率達(dá)28%［2］。但有研究顯示紫杉醇也可促進(jìn)腫瘤新生血管生成，并促進(jìn)形成腫瘤轉(zhuǎn)移微環(huán)境，以協(xié)助乳腺癌細(xì)胞進(jìn)入血循環(huán)；紫杉醇還能在肺部形成免疫抑制性微環(huán)境，使得乳腺癌細(xì)胞更易在肺部種植，導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移［3-4］。重組牛痘病毒JX-594是一種具有治療作用的溶瘤病毒，可特異性感染腫瘤細(xì)胞并在其內(nèi)復(fù)制，致使細(xì)胞裂解和死亡；還能抑制癌細(xì)胞表面血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子發(fā)揮功能的主要受體——酪氨酸激酶功能區(qū)受體（kinase domain receptor，KDR），導(dǎo)致腫瘤血管閉合或破壞，加速對癌細(xì)胞的殺傷作用［5-6］。本研究研制載紫杉醇覆膜支架和共載JX-594和紫杉醇的雙層覆膜支架，并在兔食管鱗癌模型上評價JX-594和紫杉醇的抑瘤協(xié)同效果，探討JX-594是否可有效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。

1 材料與方法

1.1 載藥食管覆膜支架制備

以自擴張編織型金屬食管支架（南京微創(chuàng)醫(yī)學(xué)科技公司）為骨架，紫杉醇為上載藥物，將紫杉醇與聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）共混，通過高壓靜電紡絲技術(shù)實現(xiàn)支架表面快速均勻的覆膜與藥物上載，制得覆膜的紫杉醇負(fù)載金屬食管支架（paclitaxel-loaded esophageal metal stent，PEMS）；將重組牛痘病毒JX-594與溶解后的甲基丙烯酸酯化明膠（GelMA）共混，均勻涂覆于PEMS表面，利用藍(lán)光交聯(lián)技術(shù)實現(xiàn)其PLGA膜層外表面GelMA膜層快速凝固成膠，實現(xiàn)JX-594均勻上載，制得雙層覆膜的紫杉醇和JX-594共載金屬食管支架（PJEMS）。經(jīng)體外研究測試，載10%紫杉醇的支架具有較好的釋放性能和細(xì)胞毒性，5 wt%GelMA具有較好的降解性能，且釋放的JX-594仍保留生物活性。選取10%紫杉醇、5 wt%GelMA+JX-594（107 pfu）支架進(jìn)一步研究。

1.2 VX2兔食管癌移植瘤模型制備

新西蘭大白兔（上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院實驗動物中心提供），體質(zhì)量2～2.5 kg。VX2腫瘤組織塊于-80℃冰箱取出，按照快速復(fù)蘇法復(fù)蘇，去上清液，加0.9%氯化鈉溶液漂洗，手動離心，重復(fù)3次后用眼科剪將組織塊剪成0.5～1.0 mm3大小，保存于0.9%氯化鈉溶液備用。兔禁食不禁水24 h后，戊巴比妥（1%，3.0 mL/kg）經(jīng)耳靜脈注射麻醉，仰臥位固定于大動物手術(shù)臺；頸部術(shù)區(qū)備皮消毒鋪單，于環(huán)甲軟骨下方偏左側(cè)約0.5 cm處作約2.0 cm縱行切口，暴露下頸段食管；采用直視注射技術(shù)將制備好的腫瘤懸液注入食管，具體操作：用1 mL注射器針管抽吸帶有腫瘤組織塊的0.9%氯化鈉溶液，針管口朝下稍靜置沉淀后使針管口處濃稠腫瘤組織體積達(dá)到約0.2 mL，連接8號針頭，針尖斜口朝外直視下行食管壁穿刺，穿刺過程中調(diào)整針尖以確定穿刺部位為黏膜下層，到達(dá)視野盡頭時完成腫瘤組織塊注射，注射區(qū)食管壁快速呈現(xiàn)白色隆起證實穿刺注射成功；拔針后，用無菌棉簽迅速按壓針眼約2 min，確認(rèn)無滲漏后關(guān)閉頸部切口并消毒。

術(shù)后實驗兔繼續(xù)禁食24 h，肌內(nèi)注射青霉素40萬U/d，連續(xù)3 d。每3～4日監(jiān)測食物攝入情況和體重，每周食管造影觀察食管腔狹窄情況。食管造影檢查顯示食管狹窄＞2/3管腔直徑時，將實驗兔隨機分配至PEMS組或PJEMS組。

1.3 食管造影

實驗兔麻醉后頭高尾低位（約30°）仰臥于檢查床，DSA透視監(jiān)視下先經(jīng)口咽部置入6 F造影導(dǎo)管，跨越腫瘤狹窄處到達(dá)胃腔，以防誤入氣管；透視下后撤導(dǎo)管至腫瘤接種處以上約2 cm處，勻速緩慢灌注碘對比劑，并旋轉(zhuǎn)球管尋找最佳角度觀察食管狹窄程度。

1.4 支架置入

同上步驟行食管造影確認(rèn)腫瘤生長位置后撤出導(dǎo)管，經(jīng)口咽部置入導(dǎo)絲直達(dá)胃腔，利用支架遞送裝置（南京微創(chuàng)醫(yī)學(xué)科技公司）于食管狹窄部位釋放支架，復(fù)查造影評估確認(rèn)支架在位情況。

1.5 觀察指標(biāo)

觀察兩組實驗兔支架置入后近期和遠(yuǎn)期并發(fā)癥，包括瘺管、穿孔、出血、支架移位、食管再狹窄和手術(shù)相關(guān)死亡等，監(jiān)測實驗兔食物攝入和體質(zhì)量丟失情況。支架置入后2周處死實驗兔，具體步驟：經(jīng)動物耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉（1%，3 mL/kg），注射20 mL空氣；完整取出食管，將支架從食管中取出，再縱向切開食管。測量食管腫瘤體積（V），V=長×寬×高/2。檢查肝、肺及胸、腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±）表示，組間比較用t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔食管鱗癌模型建立和隨訪情況

共31只新西蘭大白兔接受經(jīng)頸部外科手術(shù)食管鱗癌種植術(shù)。種瘤2～4周后，觀察到17只兔食管腔內(nèi)腫瘤形成，且食管狹窄＞2/3管腔直徑；選擇其中12只荷瘤兔行支架置入實驗，隨機分成PEMS組（n=6）和PJEMS組（n=6），術(shù)后DSA影像見圖1。支架置入過程中兩組各有1只兔窒息死亡，均無出血、穿孔等并發(fā)癥發(fā)生。術(shù)后2周內(nèi)，未見其他原因?qū)е聦嶒炌盟劳觥Ｐg(shù)后2周后兔處死時兩組均未發(fā)生支架移位。兩組各有5只荷瘤兔數(shù)據(jù)納入統(tǒng)計學(xué)分析。

圖1 實驗兔食管造影與支架置入

2.2 紫杉醇藥物支架對食管鱗癌療效分析

支架置入2周實驗兔食管DSA造影隨訪結(jié)果顯示，兩組支架均在位，均出現(xiàn)明顯的支架內(nèi)再狹窄；取支架上端至胃底段食管，觀察到支架形態(tài)明晰，與腫瘤對位良好，其中PEMS組有一只兔食管與支架下端接觸處管壁變薄，有穿孔趨向，沿支架橫向切開食管可見黏膜表面明顯非腫瘤性增生從纖維膜未覆蓋處嵌入支架腔內(nèi)。

處死實驗兔，對納入統(tǒng)計分析的實驗兔進(jìn)行藥物支架有效性評價，結(jié)果顯示PEMS組、PJEMS組平均腫瘤體積分別為（5.014±2.082）cm3、（1.286±0.463）cm3，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；兩組均可見鄰近氣管受侵犯，未見胃底種植，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移主要累及肝臟、肺和淋巴結(jié)，轉(zhuǎn)移發(fā)生率分別為3/5、1/5，其中PEMS組1只兔為肺部彌漫性轉(zhuǎn)移（圖2）；PEMS組、PJEMS組支架置入2周后，兔體質(zhì)量丟失分別為（0.334±0.084）kg、（0.162±0.177）kg，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

3 討論

藥物洗脫支架（drug-eluting stent，DES）在防止血管內(nèi)再狹窄上的成功應(yīng)用［7-10］啟發(fā)了其在非血管管腔狹窄的研究與應(yīng)用探索。一些研究陸續(xù)開展針對賁門支架置入后再狹窄難題［11］及膽道、腸道惡性腫瘤支架治療的研究與臨床應(yīng)用［12-13］。然而DES在食管癌的應(yīng)用，目前大多還局限于動物研究［14-16］。可即刻緩解食管梗阻癥狀、微創(chuàng)及局部化療以減少全身不良反應(yīng)等優(yōu)勢，使得負(fù)載各種抗腫瘤藥物的DES，在食管惡性狹窄治療中具有廣泛的應(yīng)用前景。相關(guān)DES動物實驗和前瞻性臨床研究亟待開展。紫杉醇是包括食管癌在內(nèi)多種腫瘤的一線化療藥物，對食管鱗癌單藥有效率達(dá)28%［2］。由于是脂溶性藥物，紫杉醇易于滲透細(xì)胞膜，與支架被膜材料PLGA具有天然的高親和力，該特性可確保負(fù)載于PLGA膜內(nèi)的紫杉醇能長時間且穩(wěn)定地釋放，并在釋放后快速進(jìn)入細(xì)胞膜，保證在局部組織內(nèi)發(fā)揮療效所必需的藥物濃度。另外，紫杉醇對支架置入后的反應(yīng)性增生導(dǎo)致的再狹窄也有一定抑制 效 果［17-18］。

圖2 PEMS組1只實驗兔出現(xiàn)彌漫性肺轉(zhuǎn)移

表1 支架置入2周后腫瘤大小與荷瘤兔體質(zhì)量丟失情況 ±

表1 支架置入2周后腫瘤大小與荷瘤兔體質(zhì)量丟失情況 ±

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溶瘤病毒療法作為近年研究熱點的腫瘤免疫療法一重要分支，已逐漸被臨床接受，截至目前已有H101、Rigvir?和Imlygic?（talimogene laherparepvec）等3種溶瘤病毒產(chǎn)品上市并用于頭頸部和食管鱗癌［19］及黑素瘤［20-21］治療。此外，還有CG0070（NCT 04452591、NCT01438112）、Toca511（NCT04105374、NCT02414165）、JX-594（NCT02562755）和Reolysin（NCT01166542）等溶瘤病毒產(chǎn)品，均已進(jìn)入治療膀胱癌、肝癌和頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等惡性腫瘤Ⅲ期臨床試驗研究階段。溶瘤病毒與其他腫瘤免疫療法相比，具有殺傷效率高、靶向性好、不良反應(yīng)小、多種殺傷腫瘤途徑、避免耐藥性和成本低廉等優(yōu)勢，有望成為繼免疫檢查點抑制劑后另一大突破。但溶瘤病毒自帶的抗原性極易誘發(fā)機體產(chǎn)生中和抗體，這一特性決定了其難以實現(xiàn)系統(tǒng)給藥而多以瘤內(nèi)注射為主，大大限制了其應(yīng)用。研究人員利用牛痘病毒自身細(xì)胞外包膜形式等獨特特征，開發(fā)出JX-594系列產(chǎn)品，使其在中和抗體存在情況下仍可在血流中存活，從而使其能同時進(jìn)行靜脈注射和瘤內(nèi)注射。但即使如此，也需要反復(fù)多次給藥，才可實現(xiàn)可觀的抑瘤效果［22］。為了拓寬基因類藥物制劑應(yīng)用范圍，有研究將表達(dá)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）的溶瘤腺病毒（oAd-TRAIL）包封在明膠水凝膠中，注射到荷瘤倉鼠皮下腫瘤內(nèi)，20 d后凝膠組腫瘤負(fù)荷與裸oAd-TRAIL組相比降低61.2%（P＜0.01）；值得注意的是，凝膠組6只鼠中1只出現(xiàn)腫瘤完全消退，凝膠組生存率更高，說明oAd-TRAIL與裸oAd-TRAIL相比能誘導(dǎo)更有效的生 長 抑 制，提 高 宿 主 存 活 率［23］。 劉 云 杰 等［24］報 道將TRADD基因慢病毒涂于食管支架外覆膜上，研究其對犬食管良性狹窄的抑制作用，結(jié)果證實以支架為載體可成功地將TRADD基因慢病毒轉(zhuǎn)染至食管黏膜組織中，抑制狹窄部位組織增生。但基因類藥物在食管局部釋放用于腫瘤治療研究尚無先例。

本研究采用GelMA水凝膠負(fù)載JX-594作為外膜，聯(lián)合負(fù)載紫杉醇的PLGA纖維膜一起合成雙層載藥覆膜包裹在金屬支架外表面，治療兔食管原位腫瘤模型后發(fā)現(xiàn)，共載紫杉醇和JX-594的雙層覆膜對比單純負(fù)載紫杉醇纖維膜在抑制腫瘤大小上具有顯著優(yōu)勢，PJEMS組兔平均腫瘤大小較單純PEMS組大［（5.014±2.082）cm3對（1.286±0.463）cm3］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但在抑制遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移方面僅有輕微優(yōu)勢，尚未觀察到顯著獲益，可能是受小樣本量的影響，兩組遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

本實驗研究結(jié)果仍是初步的，僅簡單比較了PJEMS組與PEMS組在腫瘤大小和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移上的差別，對于轉(zhuǎn)移灶的確定也是組織取材肉眼識別后結(jié)合病理所證實，難免遺漏一些細(xì)小轉(zhuǎn)移灶。下一步擬緊密結(jié)合影像學(xué)技術(shù)示蹤腫瘤細(xì)胞，觀察更微小腫瘤轉(zhuǎn)移征象，為紫杉醇促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移、JX-594抑制轉(zhuǎn)移提供更可靠的證據(jù)，并對腫瘤局部微血管相關(guān)蛋白及腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白進(jìn)行表征，進(jìn)一步佐證JX-594和紫杉醇的協(xié)同作用。