中藥水煎液中乳酸菌發酵降低泡菜 亞硝酸鹽含量的研究

◎ 葛瑤潔，韓 露，馮尚坤，段文凱，廖建偉

（臺州科技職業學院農學院，浙江 臺州 318000）

泡菜脆嫩芳香、口感獨特，含豐富的營養物質，同時具有健胃理氣、預防心腦血管疾病等功效，深受消費者喜愛。但腌制過程中，微生物產生的硝酸鹽還原酶將蔬菜中硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。后者在體內能將血紅蛋白Fe2+氧化，使其變為高鐵血紅蛋白，攜氧能力降低，易引起急性中毒，嚴重時可致死亡[1]。另外，亞硝酸鹽會與胃中含氮化合物結合成有強致癌性的亞硝胺[2]。

截止目前，亞硝酸鹽控制方法的研究重點在發酵方法的選擇、輔料的添加和發酵過程條件控制上。如發酵方法方面，郝明玉、陳聰等[3-4]從傳統腌制泡菜中篩選得到乳酸菌，比較了直投式和自然發酵方法的優劣。乳酸菌研究集中在篩選產酸和降解亞硝酸鹽能力較強的菌株上[5]。發酵過程，調節鹽的添加量、溫度和發酵液的PH值來降低亞硝酸鹽[6-8]。泡菜原輔料使用中，潮州菜慣用薄荷、羅勒和香菜調味，三者均有很好的亞硝酸鹽的清除和亞硝胺合成的阻斷能力[9]。另外隨著茶多酚、谷胱甘肽、維生素C添加量的增加，泡菜與泡菜液中亞硝酸鹽含量均逐漸減少[10-12]。

泡菜中添加中草藥是近年出現的一種新方法，相關研究還處于初級階段。如賈晶晶[13]等研究發現添加黃芩溶液會降低發酵白菜中亞硝酸鹽含量。我國中草藥資源豐富，使用歷史悠久，本課題在復合中藥水煎液中，采用人工接種結合自然發酵方法腌制泡菜，通過正交試驗獲得最優工藝，以期提高泡菜的安全、風味和保健功能，助力本國泡菜特色化，標準化，進而提高中式泡菜的國際地位。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豇豆、白菜、白蘿卜、胡蘿卜、黃瓜、蒜、生姜、白砂糖、食鹽（無碘）：浙江省臺州市市椒江歐尚超市；當歸、黨參、黃芪：岷縣和泰中藥材有限公司；乳酸菌：四川高福記生物科技有限公；亞硝酸鹽：分析純，江蘇強盛功能化學股份有限公司；對氨基苯磺酸：分析純，天津市化學試劑研究所；鹽酸萘乙二胺：分析純，上海麥克林生化科技有限公司；亞鐵氰化鉀：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；乙酸鋅：分析純，永華化學科技（江蘇）有限公司；乙酸：分析純，杭州化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

722sp可見分光光度計，上海棱光技術有限公司；FA1004C電子天平，上海越平科學儀器（蘇州）制造有限公司；PYX-DH450B-S電熱恒溫培養箱，上海天恒醫療器械有限公司；HH2恒溫水浴鍋，邦西儀器科技（上海）有限公司；800 mL自動排氣發酵罐，淄博治德輕工制品有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 泡菜試驗技術方法

泡菜試驗技術路線圖見圖1。

圖1 泡菜試驗技術路線圖

1.3.2 復合中藥水煎液的制備

稱取不同質量（90 g、180 g、270 g、360 g和 450 g）的復合中藥材（切片后的當歸，黨參，黃芪質量比為5∶3∶2）于3 000 mL燒杯中，加水浸泡 0.5 h，燒杯蓋上玻璃皿蓋，前后分3次共煎120 min，分別為50 min、40 min和30 min。每次煎之前加水，水量為中藥重量的5倍。單次煎煮結束趁熱過濾，最后合并3次過濾液加熱濃縮至450 mL，于121 ℃下高壓滅菌20 min。

1.3.3 發酵過程中不同蔬菜亞硝酸鹽含量的比較

蔬菜分別選擇豇豆、白菜、白蘿卜、胡蘿卜、黃瓜去雜清洗干凈，切分后，晾干（所有接觸蔬菜的刀具、案板等都提前清洗干凈，保證無油）。同時泡菜罐清洗后（無油）晾干。稱取晾干的蔬菜各225 g，分別置于泡菜罐中。用涼白開配制鹽3%、糖2%的鹽水溶液，分別倒入泡菜罐，各泡菜添加4.5 g蒜和生姜，泡菜罐做好標記，30 ℃密封腌制。每24 h檢測其中的亞硝酸鹽含量。

1.3.4 乳酸菌接種量對泡菜中亞硝酸鹽含量的影響

將新鮮的白菜清洗干凈，剝除壞葉，切去根部，切成2 cm×2 cm見方的塊狀，稱取晾干的蔬菜225 g， 生姜、大蒜各4.5 g，白砂糖9 g，置于發酵罐中。發酵罐中發酵條件：倒入0.6 g·mL-1復合中藥水煎液 450 mL，食鹽5%。泡菜罐上做好標記，密封于30 ℃腌制。各罐乳酸菌添加量依次是：0.1‰、0.2‰、0.3‰、0.4‰和0.5‰。

1.3.5 食鹽濃度對泡菜中亞硝酸鹽含量的影響

蔬菜和輔料質量及處理技術見1.3.4，發酵罐中發酵條件：倒入0.6 g·mL-1復合中藥水煎液450 mL，添加0.2‰乳酸菌。泡菜罐上做好標記，密封于30 ℃腌制。各罐的食鹽濃度依次為：1%、3%、5%、7%和9%。

1.3.6 中藥復合水煎液濃度對泡菜中亞硝酸鹽含量的影響

蔬菜和輔料質量及處理技術見1.3.4，發酵罐中發酵條件：倒入復合中藥水煎液450 mL，食鹽5%、乳酸菌0.2‰。泡菜罐上做好標記，密封于25 ℃腌制。各罐中藥復合水煎液濃度依次為：0.2 g·mL-1、 0.4 g·mL-1、0.6 g·mL-1、0.8 g·mL-1和1.0 g·mL-1。

1.3.7 發酵溫度對泡菜中亞硝酸鹽含量的影響

蔬菜和輔料質量及處理技術見1.3.4，發酵罐中發酵條件：倒入0.6 g·mL-1復合中藥水煎液450 mL，添加0.2‰乳酸菌、5%食鹽。各泡菜罐上做好標記，分別密封于20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃腌制。

1.3.8 泡菜中亞硝酸鹽含量的測定

亞硝酸鹽含量的檢測參見國家標準GB 5009.33—2016 第二法——分光光度法。

2 結果與分析

2.1 發酵過程中不同蔬菜亞硝酸鹽含量的比較結果

由圖2知，在自然發酵情況下，不同蔬菜均在第2 d達到亞硝酸鹽峰值，之后亞硝酸鹽含量慢慢下降至國家限量以下。其中尤以白菜的亞硝酸鹽含量為高，其峰值達到249.56 mg·kg-1，其他蔬菜亞硝酸鹽峰值均低于100 mg·kg-1，且同一時間，泡菜中亞硝酸鹽含量均低于白菜。為了便于觀察亞硝酸鹽含量的變化，選擇白菜進行后續試驗。

圖2 不同蔬菜發酵過程中亞硝酸鹽含量的變化圖

2.2 各因素對亞硝酸鹽峰值與終值的影響

2.2.1 乳酸菌接種量對泡菜中亞硝酸鹽含量的影響

目前已有商業化的固體泡菜乳酸菌發酵劑，方便直投式發酵泡菜或者人工接種結合自然發酵。直投式發酵亞硝酸鹽含量遠低于自然發酵，但是前者需要預先對蔬菜原料進行滅菌處理，對實驗材料風味有一定影響，且增加成本。董靜等[6]比較了人工接種結合自然發酵與純自然發酵的優劣，發現人工接種乳酸菌結合自然發酵，不僅不破壞蔬菜本身風味，而且相比自然發酵，亞硝酸鹽峰值低，降低速度快，含量少。因此，本實驗采用人工接種結合自然發酵的方法。

由圖3知，白菜本身含有一定量的亞硝酸鹽，隨著發酵時間的延長，不同乳酸菌添加量下，亞硝酸鹽含量逐漸增加，且均在24 h到達亞硝酸鹽峰值。之后，亞硝酸鹽含量迅速降低，在72 h候后變化平緩。乳酸菌添加量越高，亞硝酸鹽的峰值越低，添加量為0.1‰時，峰值達到113.7 mg·kg-1，添加量增加到0.2‰時，峰值迅速降至26.4 mg·kg-1。同時隨著添加量的增加，6 d后的亞硝酸鹽含量逐漸減少。添加量為0.5‰時，盡管亞硝酸鹽終值非常低，但是乳酸菌添加量偏大，泡菜口感過酸。經綜合考慮選擇0.2‰、0.3‰和0.4‰做后續的正交試驗。

2.2.2 食鹽濃度對泡菜中亞硝酸鹽含量的影響

在泡菜腌制初期，乳酸未大量生成，對各類雜菌的抑制作用比較弱，主要依靠食鹽來抑菌。由圖4知，不同食鹽濃度，各個泡菜的出峰時間差異比較大。1%和3%濃度是在24 h出峰，5%濃度72 h出峰，7%和9%濃度96 h出峰。這是因為食鹽濃度越高，雜菌受到的抑制作用越強，因此，亞硝酸鹽出峰時間較晚，但是同時也會一定程度上抑制乳酸菌的生長繁殖，導致峰值較高。因此可以看到6 d以后亞硝酸鹽含量隨著濃度的升高而增大。考慮到7%和9%濃度的泡菜亞硝酸鹽含量均偏高，同時口感上過咸不利健康，取1%、3%、5%做進一步的正交試驗。

圖3 不同乳酸菌添加量對泡菜中亞硝酸鹽含量的影響圖

圖4 食鹽濃度對泡菜中亞硝酸鹽含量的影響圖

2.2.3 中藥復合水煎液濃度對泡菜中亞硝酸鹽含量的影響

中藥黃芪、當歸、黨參具有補氣益血的效用，同時經研究證實，能抑制泡菜中有害雜菌的生長又對有益乳酸菌起到一定的促進作用[14]。由圖5知，黃芪、當歸、黨參的復合中藥水煎液0.2 g·mL-1和0.4 g·mL-1濃度48 h出峰，0.6 g·mL-1、0.8 g·mL-1以及1.0 g·mL-1均在24 h出峰。亞硝酸鹽峰值隨中藥濃度的增加而整體下降，但是1.0 g·mL-1濃度峰值卻較0.8 g·mL濃度的 高，這可能是因為高濃度的中藥水煎液不利于乳酸菌的生長。取出峰時間相對較前，峰值較低的0.6 g·mL-1、 0.8 g·mL-1、1.0 g·mL-1做進一步的正交試驗。

2.2.4 不同發酵溫度對硝酸鹽含量的影響

由圖6知，溫度對亞硝酸鹽出峰時間及峰值均有較大影響。發酵溫度為20 ℃和25 ℃時，均在第3 d出峰，而30 ℃、35 ℃和40 ℃均在24 h即出峰，即溫度越高，出峰時間越早。同時總體來看40 ℃以下，溫度越高，峰值越小，第6 d終值也越小。溫度從35 ℃變為40 ℃，峰值不降低反而增大，這可能是因為溫度較高以后，開始部分抑制了乳酸菌的生長繁殖，導致其他雜菌生長繁殖加快，硝酸鹽較多被還原為亞硝酸鹽。

圖5 不同濃度中藥復合水煎液對亞硝酸鹽含量的影響圖

圖6 不同發酵溫度下泡菜中亞硝酸鹽含量的變化圖

在溫度的研究上存在一些爭議，徐海菊等[15]發現高溫比低溫的亞硝酸鹽峰值低，亞硝酸鹽峰提前，這與本研究一致，但是周強[16]等人研究結果則顯示，溫度高，亞硝酸鹽含量高，出峰時間不變。這可能是原輔材料種類、微生物本底數、體系pH以及發酵過程中微生物的繁殖速度的影響所致。綜合考慮到峰值、終值以及能耗，選擇25 ℃、30 ℃和35 ℃作為后續正交試驗水平。

2.2.5 白菜泡菜最佳工藝條件優化

根據各個單因素的實驗結果，每個因素取三水平進行正交實驗，因素水平見表1。以正交設計表安排實驗，以6 d后的亞硝酸鹽含量為指標。由表2知，極差A＞B＞D＞C，即影響亞硝酸鹽含量的順序依次是乳酸菌添加量、食鹽濃度、溫度、中藥復合水煎液濃度。極差分析結果顯示，以6 d后亞硝酸鹽含量為指標，最佳制備工藝條件為A2B2C1D2。即當乳酸菌添加量0.3‰，食鹽濃度為3%，復合中藥水煎液濃度為0.6 g·mL-1，溫度為30 ℃時，亞硝酸鹽含量最低。按照這一最佳條件進行驗證試驗，6 d后亞硝酸鹽含量為0.713 mg·kg-1。從本課題研究來看，通過調整乳酸菌添加量、食鹽濃度、發酵溫度和復合中藥水煎液濃度可有效消減泡菜中亞硝酸鹽，且短期內就可以降至遠低于國家安全標準上限的范圍。

表1 L9（34）優化白菜泡菜工藝的因素水平表

表2 正交實驗結果表

3 結論

結果表明，各個因素對亞硝酸鹽含量的影響大小依次是乳酸菌添加量＞食鹽濃度＞溫度＞中藥復合水煎液濃度。當乳酸菌添加量0.3‰、食鹽濃度3%，復合中藥水煎液濃度為0.6 g·mL-1、溫度30 ℃時，6 d后亞硝酸鹽含量最低。在這樣的條件下，泡菜安全性最高，同時口感爽脆，營養豐富。