米粉中金黃色葡萄球菌定量檢測盲樣 考核結(jié)果與分析

◎ 譚艷妮，曹明明，李欣蔚，張 健，施 法

（1.沈陽食品藥品檢驗所，遼寧 沈陽 110136；2.沈陽沈化院測試技術(shù)有限公司，遼寧 沈陽 110021；3.遼寧省糧食科學(xué)研究所，遼寧 沈陽 110032）

金黃色葡萄球菌是引起食源性疾病的重要致病菌，分布較為廣泛，可污染食物、水源等，嚴(yán)重威脅著人類的身體健康[1-2]。《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中致病菌限量》（GB 29921—2013）[3]中肉制品、水產(chǎn)制品、糧食制品、即食豆類制品、即食果蔬制品（包含醬腌菜）、飲料及即食調(diào)味品都對金黃色葡萄球菌進(jìn)行了限量要求，可見金黃色葡萄球菌的檢測在食品安全檢驗中具有重要意義[4]。盲樣考核是為了保證各級食品安全承檢機構(gòu)檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，提高檢驗檢測水平，并以監(jiān)督和考核為目的的測評活動。2020年10月，沈陽市食品藥品檢驗所參加了由中國計量科學(xué)研究院組織實施總局本級食品安全承檢機構(gòu)盲樣考核測評活動，檢驗項目為“米粉中金黃色葡萄球菌的定量檢測”，最終結(jié)果為“滿意”。為提高實驗室工作質(zhì)量，總結(jié)經(jīng)驗，將實驗過程進(jìn)行回顧分析。

1 材料與方法

1.1 樣品

2個濃度水平的金黃色葡萄球菌樣品各1瓶，棕色西林瓶包裝，每瓶0.5 g，樣品編號為MDJP036和MDJP007；避光、-20 ℃儲存；樣品中菌數(shù)的參考范圍：1.0×103～1.0×106CFU·g-1。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

Baird-Parker瓊脂平板，即用型培養(yǎng)基，編號：024040A，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供；腦-心浸出液肉湯（BHI），編號：GCM917B，北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供；血平板，即用型培養(yǎng)基，編號：024070，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供；凍干血漿環(huán)，編號：029180，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供；營養(yǎng)瓊脂，編號：GCM107，北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供；磷酸鹽緩沖液（貯存液），編號：CM1022，北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供；革蘭氏染色液；營養(yǎng)肉湯，編號：CM106，北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供。。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株

表皮葡萄球菌，編號：CMCC（B）26069，購自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種保藏管理中心；金黃色葡萄球菌，編號：ATCC 6538，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.4 儀器設(shè)備與耗材

1300 series A2生 物 安 全 柜（Thermo Fisher）、IMH400-S電熱恒溫培養(yǎng)箱（Thermo Scientific）、LBI-250生化培養(yǎng)箱（上海龍躍儀器設(shè)備有限公司）、SX-700 高壓滅菌器（Tomy Autoclave) ）、微量移液器（Sartorius）、 移液器吸頭（Brand）、顯微鏡（Olympus）及一次性接種環(huán)（As One）。

1.5 方法

1.5.1 樣品前處理

將裝有考核樣品MFJP036，MFJP007的西林瓶逐瓶從-20 ℃冰箱中取出，在室溫下放置5 min。在生物安全柜中進(jìn)行無菌操作，打開西林瓶，向每瓶樣品直接加入4.5 mL磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，充分混勻后得到1∶10稀釋度的樣品勻液。吸取1∶10樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于盛有9 mL磷酸鹽緩沖液的無菌試管中，振搖試管使其混合均勻，制成1∶100的樣品勻液。按照上述操作，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次無菌吸頭。

1.5.2 樣品接種

根據(jù)樣品參考范圍1.0×103CFU·g-1到1.0×106CFU·g-1， 選擇10-2～10-8稀釋度的樣品勻液，進(jìn)行檢測，每個稀釋度分別吸取樣品勻液0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL接種量分別加入3塊Baird-Parker平板，用無菌涂布棒涂布整個平板。

1.5.3 培養(yǎng)

涂布后，將平板正置于培養(yǎng)箱36 ℃培養(yǎng)1 h，待樣品勻液吸收后，翻轉(zhuǎn)平板，倒置培養(yǎng)至48 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 典型菌落計數(shù)

本次盲樣考核共有樣品2份，每個樣品進(jìn)行3次平行測定，每個稀釋梯度接種3塊Baird-Parker平板，根據(jù)作業(yè)指導(dǎo)書中給出的菌落范圍進(jìn)行梯度稀釋，結(jié)果每份樣品均只有10-1、10-2、10-3稀釋度檢出，平板上典型菌落數(shù)見表1。

金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上呈圓形，表面光滑、凸起、濕潤，菌落直徑為2～3 mm，顏色呈灰黑色至黑色，有光澤，邊緣淺色，周圍繞以不透明圈，其外有一清晰帶。當(dāng)用接種針觸及菌落時具有黃油樣黏稠感[5]。對于典型菌落必須進(jìn)行革蘭氏染色，血平板劃線以及血漿凝固酶等試驗才能最終進(jìn)行判斷，沃氏葡萄球菌和人葡萄球菌在Baird-Parker平板上的菌落特征與金黃色葡萄球菌相當(dāng)接近，肉眼無法區(qū)分，會導(dǎo)致最終假陽性判斷。

表1 金黃色葡萄球菌定量檢測平板計數(shù)結(jié)果表

2.2 染色鏡檢

樣品MDJP036和MDJP007典型菌落革蘭氏染色鏡檢結(jié)果為G+球菌，排列呈葡萄球狀，無芽胞，無莢膜，直徑約為0.5～1.0 μm，如圖1所示。

圖1 樣品典型菌落革蘭氏染色鏡檢結(jié)果圖

2.3 血漿凝固酶試驗

每只凍干血漿西林瓶加入0.5 mL滅菌生理鹽水至完全溶解，再加入BHI肉湯培養(yǎng)物0.3 mL，充分混勻，蓋好西林瓶塞，置于36 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，每半小時觀察一次，觀察6 h，考核樣品MFJP036、MFJP007于培養(yǎng)3 h 后凝固，判定為陽性結(jié)果。同時陽性對照也于培養(yǎng)3 h后凝固，陰性對照和空白對照培養(yǎng)6 h后仍未凝固[6]。

3 結(jié)論與討論

本次盲樣考核結(jié)果中的兩份樣品，米粉中金黃色葡萄球菌定量檢測的Baird-Parker平板計數(shù)結(jié)果Z值均小于2，為滿意結(jié)果。

本次考核樣品基質(zhì)為米粉，在試驗前應(yīng)考慮到基質(zhì)可能會存在不易溶解的特質(zhì)，因此在稀釋過程中應(yīng)注意混勻，防止其對計數(shù)結(jié)果產(chǎn)生影響；所有即用型Baird-Parker平板培養(yǎng)基在使用前，應(yīng)放在36 ℃培養(yǎng)箱里干燥至表面水珠消失，防止涂布時因有水珠導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確；本次試驗嚴(yán)格按照GB 4789.10—2016中規(guī)定的培養(yǎng)基及試劑進(jìn)行培養(yǎng)和測定，為確保結(jié)果準(zhǔn)確，今后可加用金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基來降低干擾菌的影響，防止對典型菌落的錯判和漏判[7]。