米粉中金黃色葡萄球菌定量檢測盲樣 考核結果與分析

◎ 譚艷妮，曹明明，李欣蔚，張 健，施 法

（1.沈陽食品藥品檢驗所，遼寧 沈陽 110136；2.沈陽沈化院測試技術有限公司，遼寧 沈陽 110021；3.遼寧省糧食科學研究所，遼寧 沈陽 110032）

金黃色葡萄球菌是引起食源性疾病的重要致病菌，分布較為廣泛，可污染食物、水源等，嚴重威脅著人類的身體健康[1-2]。《食品安全國家標準 食品中致病菌限量》（GB 29921—2013）[3]中肉制品、水產制品、糧食制品、即食豆類制品、即食果蔬制品（包含醬腌菜）、飲料及即食調味品都對金黃色葡萄球菌進行了限量要求，可見金黃色葡萄球菌的檢測在食品安全檢驗中具有重要意義[4]。盲樣考核是為了保證各級食品安全承檢機構檢測結果準確可靠，提高檢驗檢測水平，并以監督和考核為目的的測評活動。2020年10月，沈陽市食品藥品檢驗所參加了由中國計量科學研究院組織實施總局本級食品安全承檢機構盲樣考核測評活動，檢驗項目為“米粉中金黃色葡萄球菌的定量檢測”，最終結果為“滿意”。為提高實驗室工作質量，總結經驗，將實驗過程進行回顧分析。

1 材料與方法

1.1 樣品

2個濃度水平的金黃色葡萄球菌樣品各1瓶，棕色西林瓶包裝，每瓶0.5 g，樣品編號為MDJP036和MDJP007；避光、-20 ℃儲存；樣品中菌數的參考范圍：1.0×103～1.0×106CFU·g-1。

1.2 培養基及試劑

Baird-Parker瓊脂平板，即用型培養基，編號：024040A，廣東環凱微生物科技有限公司提供；腦-心浸出液肉湯（BHI），編號：GCM917B，北京陸橋技術股份有限公司提供；血平板，即用型培養基，編號：024070，廣東環凱微生物科技有限公司提供；凍干血漿環，編號：029180，廣東環凱微生物科技有限公司提供；營養瓊脂，編號：GCM107，北京陸橋技術股份有限公司提供；磷酸鹽緩沖液（貯存液），編號：CM1022，北京陸橋技術股份有限公司提供；革蘭氏染色液；營養肉湯，編號：CM106，北京陸橋技術股份有限公司提供。。

1.3 標準菌株

表皮葡萄球菌，編號：CMCC（B）26069，購自中國醫學細菌菌種保藏管理中心；金黃色葡萄球菌，編號：ATCC 6538，購自中國工業微生物菌種保藏管理中心。

1.4 儀器設備與耗材

1300 series A2生 物 安 全 柜（Thermo Fisher）、IMH400-S電熱恒溫培養箱（Thermo Scientific）、LBI-250生化培養箱（上海龍躍儀器設備有限公司）、SX-700 高壓滅菌器（Tomy Autoclave) ）、微量移液器（Sartorius）、 移液器吸頭（Brand）、顯微鏡（Olympus）及一次性接種環（As One）。

1.5 方法

1.5.1 樣品前處理

將裝有考核樣品MFJP036，MFJP007的西林瓶逐瓶從-20 ℃冰箱中取出，在室溫下放置5 min。在生物安全柜中進行無菌操作，打開西林瓶，向每瓶樣品直接加入4.5 mL磷酸鹽緩沖液復溶，充分混勻后得到1∶10稀釋度的樣品勻液。吸取1∶10樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于盛有9 mL磷酸鹽緩沖液的無菌試管中，振搖試管使其混合均勻，制成1∶100的樣品勻液。按照上述操作，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次無菌吸頭。

1.5.2 樣品接種

根據樣品參考范圍1.0×103CFU·g-1到1.0×106CFU·g-1， 選擇10-2～10-8稀釋度的樣品勻液，進行檢測，每個稀釋度分別吸取樣品勻液0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL接種量分別加入3塊Baird-Parker平板，用無菌涂布棒涂布整個平板。

1.5.3 培養

涂布后，將平板正置于培養箱36 ℃培養1 h，待樣品勻液吸收后，翻轉平板，倒置培養至48 h。

2 結果與分析

2.1 典型菌落計數

本次盲樣考核共有樣品2份，每個樣品進行3次平行測定，每個稀釋梯度接種3塊Baird-Parker平板，根據作業指導書中給出的菌落范圍進行梯度稀釋，結果每份樣品均只有10-1、10-2、10-3稀釋度檢出，平板上典型菌落數見表1。

金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上呈圓形，表面光滑、凸起、濕潤，菌落直徑為2～3 mm，顏色呈灰黑色至黑色，有光澤，邊緣淺色，周圍繞以不透明圈，其外有一清晰帶。當用接種針觸及菌落時具有黃油樣黏稠感[5]。對于典型菌落必須進行革蘭氏染色，血平板劃線以及血漿凝固酶等試驗才能最終進行判斷，沃氏葡萄球菌和人葡萄球菌在Baird-Parker平板上的菌落特征與金黃色葡萄球菌相當接近，肉眼無法區分，會導致最終假陽性判斷。

表1 金黃色葡萄球菌定量檢測平板計數結果表

2.2 染色鏡檢

樣品MDJP036和MDJP007典型菌落革蘭氏染色鏡檢結果為G+球菌，排列呈葡萄球狀，無芽胞，無莢膜，直徑約為0.5～1.0 μm，如圖1所示。

圖1 樣品典型菌落革蘭氏染色鏡檢結果圖

2.3 血漿凝固酶試驗

每只凍干血漿西林瓶加入0.5 mL滅菌生理鹽水至完全溶解，再加入BHI肉湯培養物0.3 mL，充分混勻，蓋好西林瓶塞，置于36 ℃培養箱內，每半小時觀察一次，觀察6 h，考核樣品MFJP036、MFJP007于培養3 h 后凝固，判定為陽性結果。同時陽性對照也于培養3 h后凝固，陰性對照和空白對照培養6 h后仍未凝固[6]。

3 結論與討論

本次盲樣考核結果中的兩份樣品，米粉中金黃色葡萄球菌定量檢測的Baird-Parker平板計數結果Z值均小于2，為滿意結果。

本次考核樣品基質為米粉，在試驗前應考慮到基質可能會存在不易溶解的特質，因此在稀釋過程中應注意混勻，防止其對計數結果產生影響；所有即用型Baird-Parker平板培養基在使用前，應放在36 ℃培養箱里干燥至表面水珠消失，防止涂布時因有水珠導致結果不準確；本次試驗嚴格按照GB 4789.10—2016中規定的培養基及試劑進行培養和測定，為確保結果準確，今后可加用金黃色葡萄球菌顯色培養基來降低干擾菌的影響，防止對典型菌落的錯判和漏判[7]。