丙酮酸對豬早期胚胎發(fā)育的影響

閔昌國 車東升 張?zhí)燔?/p>

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，吉林省動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點實驗室，吉林省生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)科技創(chuàng)新中心，長春 2130118)

一直以來，如何增加產(chǎn)仔數(shù)都是養(yǎng)豬業(yè)亟待解決的問題。母豬有較高的排卵率以及較高的受精率，所以影響產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)鍵因素在于早期胚胎的丟失[1]。早期胚胎發(fā)育阻滯是一種因細(xì)胞無法繼續(xù)分裂而導(dǎo)致囊胚數(shù)量下降的現(xiàn)象[2]，通過大量研究證實，它與母源調(diào)控向胚胎調(diào)控的過渡時期一致。母源基因的降解、胚胎基因的激活在母源調(diào)控向胚胎調(diào)控的過渡時期會伴隨發(fā)生，由于此時許多調(diào)控機(jī)制較差，所以任何細(xì)微的變化及干擾都可能造成早期胚胎發(fā)育阻滯[3]。卵母細(xì)胞生長成熟過程中積累的mRNA和蛋白質(zhì)是母體調(diào)控的重要基礎(chǔ)。隨著母體物質(zhì)的消耗，胚胎自身需要開始合成生長所需的物質(zhì)，因此需要激活合子基因組，這個過程稱為合子基因組激活(zygotic genome activation，ZGA)[4-5]。早期胚胎發(fā)育所需的能量(ATP)來源主要有2條途徑，分別是葡萄糖參與的糖酵解途徑和中間產(chǎn)物為丙酮酸鹽的氧化磷酸化途徑[6]。在合子基因組激活之前，合子不能在缺乏乳酸和丙酮酸的培養(yǎng)基中存活，因為此時合子不能通過糖酵解途徑對葡糖糖進(jìn)行利用[7]。然而當(dāng)培養(yǎng)基中只留下丙酮酸鹽時，胚胎可以存活，但不能發(fā)育到2細(xì)胞階段之后[8]，所以丙酮酸是此時重要的能量物質(zhì)。胚胎發(fā)育阻滯的時期雖然會因物種的不同而有所差異，但都發(fā)生在胚胎從輸卵管向子宮轉(zhuǎn)移的過程中，而丙酮酸和乳酸正是此時輸卵管液中所含的重要物質(zhì)[3]。綜上所述，推測丙酮酸可能是影響早期胚胎發(fā)育的一種關(guān)鍵物質(zhì)。本文總結(jié)了丙酮酸在早期胚胎發(fā)育中的應(yīng)用，為提高早期胚胎發(fā)育質(zhì)量、增加母豬產(chǎn)仔數(shù)以及母豬妊娠前后的精準(zhǔn)飼喂提供新的可能。

1 丙酮酸代謝

丙酮酸產(chǎn)生于細(xì)胞質(zhì)中，有以下幾個來源(圖1)。一個主要來源是葡萄糖通過厭氧糖酵解分解成2個丙酮酸分子，最終由丙酮酸激酶產(chǎn)生。絕大部分丙酮酸是通過乳酸脫氫酶氧化乳酸產(chǎn)生的，也可以通過胞質(zhì)蘋果酸酶由蘋果酸重新合成。丙酮酸對其三羧酸(tricarboxylic acid cycle，TCA)循環(huán)代謝物(如檸檬酸鹽、蘋果酸鹽和草酰乙酸鹽)穿梭胞質(zhì)和線粒體之間起重要作用。丙酮酸的最后一個重要來源是三碳氨基酸的分解代謝。首先以丙氨酸和2-氧戊二酸為底物，然后在丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)催化下轉(zhuǎn)化為谷氨酸和丙酮酸。線粒體基質(zhì)中也有丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性成分，丙氨酸可以轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體中，然后轉(zhuǎn)化為丙酮酸[9-10]。此外，絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸和半胱氨酸也能夠轉(zhuǎn)化為丙酮酸。在大多數(shù)組織中，由這些途徑產(chǎn)生的大量胞質(zhì)丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體。同時，丙酮酸也可以通過雙向細(xì)胞質(zhì)酶——乳酸脫氫酶(LDH)還原成乳酸，包括2種不同的形式：LDH-A有利于從丙酮酸轉(zhuǎn)化成乳酸，LDH-B有利于從乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸[11]。

圖1 丙酮酸代謝途徑

2 丙酮酸的生理功能

2.1 丙酮酸作為能量物質(zhì)

有研究證明，丙酮酸是卵母細(xì)胞和合子能夠直接利用的主要能量底物[12]。牛的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus oocyte complexes，COCs)成熟過程中添加丙酮酸鈉后，成熟率和受精率均顯著提高[13]。當(dāng)培養(yǎng)液中不含葡萄糖時，牛的肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞無法生長，但向其中添加10 mmol/L的丙酮酸后則可以繼續(xù)生長，表明丙酮酸在某些情況下可以替代葡萄糖成為很好的能量來源[14]。此外，有研究表明卵丘卵母細(xì)胞在不含葡萄糖的培養(yǎng)基中，消耗的丙酮酸是裸卵的5～6倍[15]。從以上結(jié)果可以看出，丙酮酸在培養(yǎng)基中可以作為能量底物被代謝。

2.2 丙酮酸作為抗氧化劑

丙酮酸在氧化還原中扮演著重要角色，參與胚胎的抗氧化應(yīng)激[16]。丙酮酸可以抵抗由過氧化氫造成的氧化損傷[17]，過氧化氫通過bcl-2和bax基因的線粒體通路誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而丙酮酸可以阻斷此通路[18]。與此結(jié)果一致，Lamirande等[19]試驗結(jié)果表明，在同時含有丙酮酸與乳酸的培養(yǎng)基中，精子避免了由活性氧(ROS)造成的氧化損傷。而且，當(dāng)過氧化氫使細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)下調(diào)、p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸化時，丙酮酸可以逆轉(zhuǎn)這些過程[20]。

此外，抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵機(jī)制還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH/NAD)和還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)也會受到丙酮酸的影響。首先，丙酮酸可以轉(zhuǎn)化為乳酸改變NADH/NAD，然后通過增強(qiáng)檸檬酸的代謝改變GSH/GSSG[21]。綜上所述，丙酮酸在抗氧化應(yīng)激中發(fā)揮著重要作用。

2.3 其他作用

神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、細(xì)胞生長和增殖等一系列反應(yīng)都離不開一個關(guān)鍵激活信號——胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度的增加[22]，而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子信號正是丙酮酸一個潛在作用。丙酮酸可以影響鈣離子通道(CRAC)，主要是通過激活CRAC釋放鈣離子，提高鈣離子進(jìn)入細(xì)胞的量[23]，從而影響通過鈣離子調(diào)控的細(xì)胞進(jìn)程[24]。

3 早期胚胎發(fā)育

3.1 胚胎發(fā)育阻滯

當(dāng)早期胚胎在體外培養(yǎng)到一定發(fā)育階段時，出現(xiàn)細(xì)胞無法分裂、囊胚數(shù)減少等問題，此時便發(fā)生了胚胎發(fā)育阻滯。胚胎發(fā)育阻滯在牛、猴、人等大型哺乳動物中非常普遍，但胚胎發(fā)育阻滯出現(xiàn)時期由于物種不同而存在差異，如小鼠、大鼠胚胎發(fā)育阻滯發(fā)生在2細(xì)胞期，人一般在4～8細(xì)胞期[25-26]，牛、山羊、綿羊在8～16細(xì)胞期，兔在桑葚胚期[1]，豬主要在4細(xì)胞期[27]。有研究報道P66Shc蛋白作為一種氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠在發(fā)育阻滯的胚胎中高表達(dá)，這表明胚胎發(fā)育阻滯受胚胎內(nèi)ROS含量的影響[28]。

3.2 合子基因組激活

植入前，哺乳動物胚胎發(fā)育從受精后開始，并在輸卵管中由單細(xì)胞發(fā)育到囊胚。豬胚胎發(fā)育到囊胚需要7 d，且豬胚胎的脂質(zhì)水平要高于小鼠和人類胚胎[29]。植入前的哺乳動物胚胎面臨著一個關(guān)鍵時期——ZGA，如果合子基因組轉(zhuǎn)錄失敗，它們的細(xì)胞周期就會停止[30]。因為成熟的MⅡ卵母細(xì)胞和胚胎在前幾個卵裂期被認(rèn)為轉(zhuǎn)錄沉默[31]，所以在受精前，卵母細(xì)胞合成并積累大量的RNA轉(zhuǎn)錄本，母源物質(zhì)在ZGA之前對胚胎發(fā)育進(jìn)行編程。第1波基因轉(zhuǎn)錄在母源物質(zhì)降解和合子基因開始表達(dá)中起著重要作用[32]。在小鼠和其他物種中觀察到了次要轉(zhuǎn)錄波(次要ZGA)和主要轉(zhuǎn)錄波(主要ZGA)[25，30，33]。然而，ZGA的機(jī)制，特別是在哺乳動物中的機(jī)制，并不完全清楚。

與ZGA相關(guān)的過程依賴于染色質(zhì)的各種三維結(jié)構(gòu)變化和基因組的表觀遺傳變化[34-35]，且表觀遺傳重編程對于早期胚胎發(fā)育過程中的特定基因調(diào)控至關(guān)重要[36]。組蛋白修飾的全基因組重編程發(fā)生在哺乳動物胚胎發(fā)育過程中，包括組蛋白去甲基化、去乙酰化，以及特定染色質(zhì)區(qū)域的其他修飾[37-39]。組蛋白N末端的賴氨酸乙酰化在調(diào)節(jié)整體染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因轉(zhuǎn)錄中起關(guān)鍵作用[40-42]，通過中和與雙鏈DNA相互作用的N末端的電荷或者提供轉(zhuǎn)錄因子與溴域的結(jié)合位點來促進(jìn)轉(zhuǎn)錄激活[43]。因此，在植入前階段，組蛋白乙酰化的增強(qiáng)有助于ZGA在胚胎中的表達(dá)。

3.3 ROS對早期胚胎發(fā)育的影響

ROS在早期胚胎發(fā)育中的確切作用尚未完全確定。相比之下，在培養(yǎng)體系中使用含抗氧化劑的商業(yè)培養(yǎng)基可以維持胚胎中促氧化劑-抗氧化劑的平衡，從而改善胚胎營養(yǎng)環(huán)境[44]。在體外培養(yǎng)中，ROS對體外受精(invitrofertilization，IVF)有重要影響[44]，培養(yǎng)基中的ROS主要來源于胚胎的新陳代謝及其周圍環(huán)境[45]。氧化應(yīng)激被定義為各種ROS穩(wěn)態(tài)水平增加導(dǎo)致超過機(jī)體抗氧化防御能力的現(xiàn)象[46]。氧化應(yīng)激對許多類型的細(xì)胞都會產(chǎn)生影響，如對早期胚胎發(fā)育的阻滯和延緩現(xiàn)象[47]。研究表明，培養(yǎng)過細(xì)胞的廢棄培養(yǎng)液中ROS的濃度與胚胎卵裂或囊胚形成的程度相關(guān)[48-51]。氧化應(yīng)激會對細(xì)胞環(huán)境產(chǎn)生有害影響，同時對受精造成負(fù)面影響，損害胚胎細(xì)胞生長、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致胚胎破碎[52]。

細(xì)胞為了維持正常的氧化還原穩(wěn)態(tài)，需要借助包括抗氧化酶和非酶抗氧化劑的抗氧化系統(tǒng)來實現(xiàn)，例如維生素A、維生素C、維生素E、GSH和礦物質(zhì)鋅、硒[53-54]。非酶類抗氧化劑有不同的作用機(jī)制：硒是重要的谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)和硫氧還原蛋白等抗氧化酶的組成部分[55]；維生素E(生育酚)防止脂質(zhì)過氧化[56]；N-乙酰半胱氨酸(NAC)是GSH前體[54]；NAC和丙酮酸可作為ROS的清除劑[57-59]。有研究表明，丙酮酸在氧化應(yīng)激模型中的保護(hù)作用，不僅可以通過中和過氧化氫(H2O2)和ROS實現(xiàn)，還可以維持線粒體氧化應(yīng)激下的膜電位并減少ROS的生成[20，60-62]。丙酮酸是幾種代謝途徑的關(guān)鍵中間化合物，通過糖酵解途徑從葡萄糖中產(chǎn)生，也可以通過糖異生轉(zhuǎn)化為碳水化合物。丙酮酸是線粒體ATP產(chǎn)生的關(guān)鍵底物[18]，是細(xì)胞的重要能量供應(yīng)者，其主要途徑有2種：第1種為通過厭氧發(fā)酵，在缺氧時產(chǎn)生乳酸；第2種為在有氧時促進(jìn)TCA循環(huán)。

4 丙酮酸對早期胚胎發(fā)育的影響

哺乳動物的成功繁殖在很大程度上取決于卵母細(xì)胞的質(zhì)量，這對受精后的胚胎發(fā)育至關(guān)重要。除了遺傳因素外，卵母細(xì)胞的質(zhì)量在很大程度上受卵泡環(huán)境及其在排卵后獨立生存能力的影響[63]。排卵后，卵母細(xì)胞幾乎完全依靠其約100 000個線粒體中的ATP存活，直到致密的桑葚胚期后開始進(jìn)行糖酵解，然后將囊胚植入子宮[64]。雖然不同哺乳動物的卵母細(xì)胞代謝底物基本相同，但是它們對這些底物的依賴性各不相同。卵母細(xì)胞在卵泡發(fā)育過程中通過卵丘細(xì)胞獲得丙酮酸，丙酮酸是大多數(shù)哺乳動物卵母細(xì)胞重要的代謝底物[64]。

影響受精后發(fā)育的另一重要因素是精子質(zhì)量。哺乳動物的精子依賴于三磷酸腺苷的有效生成，為獲能和受精提供能量[65]。前進(jìn)運(yùn)動對于精子穿過子宮頸到達(dá)輸卵管是必要的，劇烈且不對稱的游動模式有助于精子從輸卵管上皮中釋放，隨后穿過卵母細(xì)胞膜[66-67]。極度活躍的運(yùn)動和酪氨酸磷酸化是獲能的2個標(biāo)志，是1個精子為受精做準(zhǔn)備的過程。葡萄糖、丙酮酸和乳酸以高濃度存在于輸卵管液中[68]，它們通常用作哺乳動物精子的能量底物[69-71]。根據(jù)其環(huán)境中的氧供應(yīng)量和代謝底物的組成，哺乳動物的精子在不同的代謝途徑之間切換，以此來解決能量需求問題[72]。

4.1 合子基因組激活之前

葡萄糖代謝的測量表明，著床前，胚胎卵裂期的葡萄糖消耗量通常比囊胚期低10倍以上[73]。代謝過程(如TCA循環(huán))與細(xì)胞的整體能量學(xué)一致，因此也會減弱[74]。令人驚訝的是，當(dāng)培養(yǎng)基中不添加蛋白質(zhì)和氨基酸時，小鼠胚胎可以正常發(fā)育，盡管1細(xì)胞和2細(xì)胞胚胎氨基酸積累程度、線粒體耗氧量和葡萄糖氧化量均處于非常低的水平，但它們?nèi)酝瓿闪苏麄€穩(wěn)態(tài)過程[75]。早期胚胎的低代謝活性可使ROS保持較低的水平，從而避免了細(xì)胞全能性階段的DNA損傷[76]。

胚胎消耗各代謝產(chǎn)物的程度不盡相同。例如，只有一部分丙酮酸在線粒體中被完全氧化或被乳酸脫氫酶還原為乳酸[73]。乳酸和丙酮酸都存在于輸卵管液中，并以相似的比例包含在體外培養(yǎng)體系中。合子不能在缺乏乳酸和丙酮酸的培養(yǎng)基中存活。當(dāng)僅保留丙酮酸時，胚胎則會有一定活力，但不能越過合子基因組激活[8]。在這些條件下，胚胎細(xì)胞中NAD+/NADH較低，因此無法有效利用乳酸。葡萄糖在桑葚期之前基本不被氧化，添加的葡萄糖不能轉(zhuǎn)化為丙酮酸[73]，所以額外添加丙酮酸對胚胎發(fā)育是必須的。

4.2 合子基因組激活之時

在小鼠中，受精卵經(jīng)歷3～4輪細(xì)胞分裂，在8細(xì)胞階段緊密結(jié)合，然后產(chǎn)生桑葚胚。第1步分化產(chǎn)生1個含有內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的囊胚細(xì)胞，胚胎固有的祖細(xì)胞和周圍的外胚層細(xì)胞形成胚外組織。小鼠植入前發(fā)育大約需要4 d，人類大約需要6 d，豬大約需要7 d，然后囊胚在子宮著床[77-78]。為了能夠完成植入前的發(fā)育，胚胎必須激活合子基因組。此過程中，母本和父本基因組的許多結(jié)構(gòu)和表觀遺傳發(fā)生了變化，這些變化使胚胎發(fā)生了重編程。如此規(guī)模的基因組重編程需要諸多代謝物的支持，例如蛋白質(zhì)合成和DNA甲基化必不可少的α-酮戊二酸(α-KG)、蛋白質(zhì)乙酰化所需的乙酰輔酶A、底物磷酸化所需的ATP、糖基化所需的UDP-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)[79-80]，而這些過程都涉及對丙酮酸的利用。

丙酮酸首先在丙酮酸脫氫酶復(fù)合體( pyruvate dehydrogenase complex，PDHC)作用下轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，進(jìn)而調(diào)節(jié)TCA循環(huán)。丙酮酸脫氫酶復(fù)合體包含一個限速亞單位——丙酮酸脫氫酶復(fù)合體α亞單位(PDH E1α，PDHA1)，復(fù)合體的主要成分為丙酮酸脫氫酶(PDH)。丙酮酸脫氫酶磷酸酶(PDP)會使PDHA1去磷酸化(激活)，而丙酮酸脫氫酶激酶(PDK)會使PDHA1磷酸化(失活)[81-82]。在一項關(guān)于小鼠和人類胚胎的研究中發(fā)現(xiàn)，線粒體PDHA1和TCA循環(huán)相關(guān)酶在ZGA過程中瞬時移動到細(xì)胞核，并在表觀遺傳重編程中發(fā)揮重要作用[83]。然而，迄今為止，只有少數(shù)關(guān)于ZGA期間PDHA1核積累的時間和功能的研究被報道。PDH通常在線粒體中將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，然后TCA循環(huán)代謝產(chǎn)物可以被其他核酶利用。但Zhou等[84]研究結(jié)果表明，在ZGA期間，PDH轉(zhuǎn)移到豬胚胎的細(xì)胞核并高度表達(dá)，通過產(chǎn)生足夠量的乙酰輔酶A來維持組蛋白乙酰化水平，核PDH是豬合子基因轉(zhuǎn)錄和胚胎發(fā)育所必需的。

5 小 結(jié)

丙酮酸通過降低卵母細(xì)胞內(nèi)ROS含量、提高GSH含量，影響卵母細(xì)胞母體基因的表達(dá)，從而促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟。可能是因為在不同的營養(yǎng)條件下，PDK通過磷酸化PDHA1調(diào)節(jié)能量平衡。丙酮酸可以加快精子獲能，可能是通過提高精子內(nèi)源性ATP水平來實現(xiàn)，從而進(jìn)一步引發(fā)過度活化和酪氨酸磷酸化。作為能量底物和抗氧化劑，丙酮酸具有雙重功能作用，保護(hù)細(xì)胞免受體外環(huán)境的壓力。在受精卵合子基因組激活之前，丙酮酸是主要的供能物質(zhì)，合子基因組激活時，大量生命過程被啟動，線粒體卻表現(xiàn)出較低的活性，可能是由于此時PDHA1和TCA循環(huán)相關(guān)酶瞬時轉(zhuǎn)移到核中，并在核中進(jìn)行對丙酮酸的利用以及進(jìn)行表觀重編程。

通過丙酮酸目前在豬生產(chǎn)上的應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，丙酮酸是低蛋白質(zhì)飼糧中谷氨酸的有效替代品，可以減少豬的氮排泄和氮消耗[85]，但在繁殖性能中的功能及表現(xiàn)還沒有報道。細(xì)胞內(nèi)許多獨立功能的發(fā)揮離不開丙酮酸的參與，缺乏外源提供丙酮酸的細(xì)胞會面臨氧化應(yīng)激和能量供給不足的雙重壓力，乳酸可以在沒有丙酮酸的情況下使用，但是由于NAD+/NADH低，乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸的速率不足以維持一類代謝物的水平[84]。PDH是一種必需酶，在哺乳動物胚胎的代謝和表觀遺傳調(diào)控中具有雙重作用，并且其他與丙酮酸代謝有關(guān)的一些線粒體代謝酶可能在哺乳動物ZGA中發(fā)揮重要的保守作用，其在線粒體和核之間的再定位機(jī)制還有待研究[84]。在豬早期胚胎發(fā)育中，關(guān)于丙酮酸的研究還未延伸到合子發(fā)育，但其作用卻不容忽視。