N-乙酰半胱氨酸對HT22細胞輻射誘導氧化應激及增殖和凋亡的影響

黃 越，陳乃耀，趙 輝，閆振宇，張海霞，趙雪聰，張丁平

(1.華北理工大學附屬醫學院血液內科，河北 唐山 063000；2.天津商業大學生物技術與食品科學學院重點實驗室，天津 300134)

隨著顱腦腫瘤的發病率逐漸升高，顱腦放射治療已成為顱內原發和繼發腫瘤的主要治療手段[1]。但輻射會損傷周圍健康的腦組織，產生輻射相關的認知功能障礙[2]。目前對于導致輻射相關的認知功能障礙的病理生理學仍缺乏深入的了解，也缺乏行之有效的預防和治療措施。研究發現，輻射相關認知功能障礙與海馬區神經元的丟失、減少新生神經元的產生關系密切[3]。其中輻射導致的活性氧的過量積聚和神經炎癥是神經元丟失的重要原因[4]。電離輻射可直接與關鍵的有機生物分子相互作用產生自由基；也可間接通過分解細胞內的水產生活性氧(ROS，電離的間接效應)，如H2O2、O2-·和·OH[5]。這些過度生成的ROS不僅會破壞DNA的含氮堿基、嘌呤、嘧啶和脫氧核糖骨架，還會損傷線粒體DNA、蛋白質/酶和膜，使線粒體中ATP生成障礙，誘發細胞凋亡[6]。了解顱腦照射對神經元細胞的影響及分子機制，可能為改善臨床暴露于電離輻射后認知障礙的防治策略提供重要線索。HT22細胞是一種永生化的小鼠海馬脊髓細胞系，與未分化的神經干細胞相似并表達神經元特異性烯醇化酶和神經絲蛋白，已被廣泛用作中樞神經系統退行性疾病的體外模型[7]。本實驗應用直線加速器放射治療機照射HT22細胞，應用N-乙酰半胱氨酸干預，觀察細胞內活性氧及其代謝產物的變化，以及對HT22細胞增殖和凋亡的影響，以期探討放射性腦損傷的發生機制，并為放射性腦損傷防治提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

小鼠海馬神經元細胞系HT22細胞購自上海賽百康生物技術有限公司；直線加速器放射治療機(美國VARIAN公司)由華北理工大學附屬醫院放療科提供；胎牛血清購自PAN；0.25%EDTA-胰酶購自美國Gibico公司；抗青霉素/鏈霉素溶液、DMEM高糖培養基均購自CORNING公司；抗氧化劑NAC購自梯希愛(上海)化成工業發展有限公司；FITC Annexin V Apoptisis Detection Kit購自美國BD公司；GSH、SOD、MDA試劑盒購自南京建成生物技術有限公司；冰醋酸購自天津化學試劑公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自ZOMANBIO；BCA法蛋白定量試劑盒購自MultiSciences公司；BSA購自BOVOGEN； DCFH-DA購自Caymar；抗β-actin抗體購自 Abcam公司；抗cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2抗體購自北京博奧森公司；鼠二抗體購自KPL公司。

1.2 實驗方法

1.2.1HT22細胞培養

將HT22細胞培養在T25培養瓶中，加入含有10%FBS、1%青鏈霉素的DMEM高糖培養基，37 ℃、5%CO2細胞培養箱內培養，待細胞長至80%～90%融合時，1∶4傳代。

1.2.2細胞用藥配制

CCK-8確定NAC的最佳給藥劑量為5 mmol/L。稱取1.35 g NAC，溶于超純水配成1 mol/L的儲存液，并通過0.22 μm膜過濾除去細菌，使用前用DMEM高糖完全培養基配成5 mmol/L的工作液，用于后續實驗。

1.2.3細胞輻射模型的建立及輻射劑量范圍的確定

1.2.4實驗分組

實驗分組為：①空白對照組(Control)：加入完全培養基，不給予照射；②單純輻射組(RT)：加入完全培養基，給予10 Gy X射線照射；③輻射+NAC組(RT+NAC)：用NAC預先處理HT22細胞1.5 h后加入完全培養基，再給予10 Gy X射線照射。

1.2.5HT22細胞形態變化觀察

細胞接種T12.5培養瓶后，當細胞密度達70%時，按分組給予不同刺激，24 h后用倒置顯微鏡觀察并隨機拍攝5個視野，記錄細胞數量及生長形態變化。

1.2.6CCK-8法檢測HT22細胞增殖

細胞接種于96孔板后，培養24小時后按分組給予不同刺激，CCK-8法檢測HT22細胞的增殖率，每組設置3個復孔。

1.2.7Annexin/PI雙標記法檢測HT22細胞凋亡

布置于彎管側壁面的貼片(方1～14)損傷形貌特征主要表現為：除了串坑外，砂粒沖擊的坑明顯直徑較小，分布密集,這是因為彎管段沖蝕和腐蝕并存并交互影響，但又有不同的優勢區。當流動攜帶的砂粒與貼片接觸時間較長且法向沖擊速度較小時，管道壁面上容易產生劃痕；當接觸時間較短且沖擊應力較大時，材料表面上主要產生壓痕。材料大部分的質量損失都是條狀劃痕和三角狀壓痕引起的，壓痕和劃痕是砂粒沖蝕的主要破壞形式。結合彎管流場分析可知，彎管外拱壁處流動在較高壓強和離心力作用下，固相顆粒具有較大的動量，顆粒頻繁、多次沖擊壁面，致使金屬表層材料的剝落十分嚴重。

細胞分組及處理后繼續培養24 h，用無EDTA胰酶消化，收集細胞和上清液，用PBS清洗2次；1 000 r/min，離心5 min，棄上清液，加入適量1×Binding Buffer重懸細胞，使細胞密度大約為1×106個/mL。加入5 μL Annexin V-FITC避光染色15 min，再加入5 μL PI，室溫、避光孵育5 min；1 h內流式細胞儀檢測熒光強度。

1.2.8細胞內ROS檢測

細胞分組及處理后繼續培養24 h，加入DCFH-DA染液，37 ℃溫箱中孵育30 min，熒光顯微鏡(TE-2000 Nikon，日本)下隨機拍照記錄5個高倍鏡視野，應用圖像分析軟件(Image J 1.47i)軟件計算出綠色熒光強度的平均值，熒光強度可間接反映細胞內氧化應激的情況，實驗重復3次。

1.2.9細胞內GSH、SOD，MDA水平

細胞分組及處理后繼續培養24 h，收集細胞，用預冷PBS洗滌2次，超聲破碎細胞，Bradford法測定蛋白濃度，嚴格按試劑盒說明書步驟操作，分光光度計檢測細胞內GSH、MDA水平及SOD活性。

1.2.10Western blot法檢測HT22細胞中促凋亡及抗凋亡蛋白

細胞分組及處理后繼續培養24 h，用預冷PBS洗滌2次，加入蛋白質裂解液裂解，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，回收上清(蛋白質)，取少量上清液用BCA試劑盒測定蛋白濃度，剩余上清液進行蛋白測定。等量上樣，進行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上、5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST洗膜3次，每次10分鐘，然后一抗4 ℃孵育過夜(抗β-actin 1∶50 000稀釋，抗Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2 1∶1 000稀釋)，TBST洗膜3次，每次10 min，二抗室溫搖床孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，利用增強化學發光技術顯影，用ImageJ軟件進行灰度值分析。每組實驗重復3次。

1.3 統計學處理

應用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析：測量資料以均數±標準差表示，所得數據進行單因素方差分析，p<0.05表示差異具有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 照射劑量對HT22細胞存活率的影響

如圖1所示，給予HT22細胞不同照射劑量后，CCK-8結果顯示，2 Gy照射劑量對細胞增殖無明顯影響，當照射劑量大于2 Gy時，隨著照射劑量的增加，HT-22細胞增殖率呈劑量依賴性降低(p<0.01)，當照射劑量為10 Gy時，細胞增殖率接近50%。

注：**與0 Gy輻射劑量組比較, p<0.01(n=3)。圖1 不同劑量X射線照射對HT-22細胞增殖活力的影響Fig.1 Effect of different doses of X rayon the viability of HT-22 cells

2.2 RT和NAC對HT22細胞增殖率的影響

如圖2所示，給予10 Gy X射線照射，分組處理后繼續培養24 h，CCK-8法檢測HT22細胞的增殖率。與Control組相比，RT組HT22細胞增殖率明顯受到抑制(p<0.01)；與RT組相比，RT+NAC組HT22細胞增殖率明顯增高(p<0.01)。

注：**與Control組相比，p<0.01；##與RT組相比，p<0.01。圖2 RT和NAC對HT22細胞增殖率的影響Fig.2 Effects of RT and NAC on theproliferation rate of HT22 cells

2.3 RT和NAC對HT22細胞凋亡的影響

給予10 Gy X射線照射，分組處理后繼續培養24 h，應用Annexin/PI雙標記法檢測HT22細胞凋亡率，結果示于圖3。由圖3可見，與Control組相比，RT組細胞凋亡率顯著增加(p<0.01)，與RT組相比，RT+NAC組細胞凋亡率顯著減少(p<0.01)。

2.4 RT和NAC對HT22細胞內ROS水平的影響

細胞分組及處理后繼續培養24 h，加入DCFH-DA染液，熒光顯微鏡檢測 DCF 的熒光強度，結果示于圖4。由圖4可見，與Control組相比，RT組熒光強度顯著增強(p<0.01)，提示細胞內活性氧的水平顯著增高；與RT組相比，RT+NAC組熒光強度顯著減弱(p<0.01)，提示細胞內活性氧的水平降低。

2.5 RT和NAC對HT22細胞內GSH、MDA水平及SOD活性的影響

細胞分組及處理后繼續培養24 h，分光光度計檢測細胞內GSH、SOD、MDA水平，結果示于圖5。由圖5可見，與Control組相比，RT組細胞內MDA顯著增加(p<0.01)，GSH水平及SOD活性顯著降低(p<0.01)。與RT組相比，RT+NAC組細胞內MDA顯著減少(p<0.01)，GSH水平及SOD活性顯著增強(p<0.01)。

注：**與Control組相比，p<0.01；##與RT組相比，p<0.01。圖3 RT和NAC對HT22細胞凋亡的影響Fig.3 Effects of RT and NAC on apoptosis of HT22 cells

圖4(A) RT和NAC對HT22細胞內ROS的熒光強度的影響(200×)Fig.4(A) Effects of RT and NAC on thefluorescence intensity of ROS in HT22 cells

注：**與Control組相比，p<0.01；##與RT組相比，p<0.01。圖4(B) ROS熒光強度定量分析Fig.4(B) Quantitative analysis of ROSfluorescence intensity

2.6 RT和NAC對HT22細胞內促凋亡及抗凋亡蛋白的影響

結果示于圖6。由圖6可見，Western blot結果顯示與Control組相比，RT組細胞內凋亡蛋白Cleaved-caspase-3及Bax/Bcl-2顯著增加(p<0.01)。與RT組相比，RT+NAC組細胞內Cleaved-caspase-3及Bax/Bcl-2顯著減少(p<0.01)，但仍比對照組高近一倍。

3 討論

注：**與Control組相比，p<0.01；##與RT組相比，p<0.01。圖5 RT和NAC對HT22細胞內GSH、MDA、SOD水平的影響Fig.5 Effects of RT and NAC on the levels of GSH, MDA and SOD in HT22 cells

注：**與Control組相比，p<0.01；##與RT組相比，p<0.01。圖6 RT和NAC對HT22細胞內蛋白含量的影響Fig.6 Effect of RT and NAC on protein content in HT22 cells

眾所周知，海馬區在學習和記憶中扮演著重要角色。全腦放療過程中海馬神經干細胞損傷是記憶衰退的核心，海馬適形回避與記憶保存有關[8]。在成年哺乳動物大腦中，海馬齒狀回的顆粒下區(subgranular zone, SGZ)的神經干細胞(Neural stem cells, NSCs)可以在不同的刺激下分化產生新的神經元[9]。神經祖細胞/干細胞經歷增殖、分化、遷移和成熟的過程通常被認為是神經發生的過程。這一過程對氧化應激極為敏感，氧化應激和神經原性微環境中氧化還原平衡的持續改變被認為是輻射介導的海馬神經發生變化的重要原因[3]。盡管導致輻射誘導的腦損傷細胞和分子機制尚不清楚，但一般認為，放療所致的神經元發生減少、丟失過多以及存活神經元細胞的結構和功能的變化是導致認知功能障礙主要原因。電離輻射可引發增殖神經元細胞(主要是激活神經干細胞和神經祖細胞)的凋亡，導致新生神經元發生減少[10-11]；也可導致神經干細胞微環境的炎癥和血管損傷抑制神經元細胞的增殖與再生[12]。研究發現，電離輻射以劑量依賴性的方式誘導海馬區和室下區神經前體細胞的丟失，與細胞中ROS的產生密切相關[13]。即使是低劑量的輻射也會導致氧化應激的持續升高和海馬神經發生持續抑制。許多硫醇抗氧化劑曾被用作放射防護劑，但由于其毒性而受到限制。NAC作為一種具有抗氧化特性、耐受性好、安全的非處方藥物，已在世界各地廣泛使用。研究表明，NAC可能參與調節多種精神和神經疾病的病理生理過程，包括氧化應激、神經發生和細胞凋亡、線粒體功能障礙、神經炎癥等[14]。我們用HT22細胞建立輻射損傷的細胞模型，應用NAC進行干預，觀察輻射后細胞內氧化應激變化情況，以及對HT22細胞增殖和凋亡的影響，旨在探討放射性神經元損傷的發生機制，為放射性腦損傷的防治提供新的思路。

越來越多的證據表明，ROS、GSH、SOD、MDA與氧化應激密切相關[15]。與其他器官相比，大腦具有更高水平的不飽和脂肪酸并需要消耗更多氧氣進行代謝[16]。受到損傷后大腦內氧氣消耗增加可能會促進超氧陰離子的產生，并引發一系列級聯反應，形成H2O2和OH-，從而導致ROS形成[17]。NAC作為半胱氨酸的前體，進入細胞后直接與ROS發生親核反應，以清除ROS。在體外實驗中發現，NAC可直接清除H2O2、羥基自由基和次氯酸[18]。增加的ROS攻擊細胞分子如膜脂、蛋白質和核DNA，與多不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應，形成脂質過氧化物MDA，導致膜不穩定和脂質過氧化。因此細胞內MDA的含量變化常常能反映機體脂質過氧化的程度，間接反映細胞受損的程度[19]。NAC可以保護細胞膜免受脂質過氧化和蛋白質氧化，并有助于維持細胞器的完整性[20-21]。因此，NAC可減少細胞內ROS和MDA的積聚，這與本實驗結果一致。

NAC也可通過酶促防御系統(SOD)或非酶系統(GSH)抵抗氧化應激的損傷[22-23]。NAC既是GSH的類似物又是細胞內合成GSH的前體，具有恢復細胞氧化還原穩態的特性，在保護細胞免受輻射誘導的氧化應激中發揮重要作用[18]。體外和體內研究均表明，NAC不僅能夠通過將細胞外胱氨酸還原為半胱氨酸來補充細胞內GSH[24]，還可以通過補充巰基(—SH)基團刺激GSH合成并提高谷胱甘肽-S-轉移酶的活性[25]。NAC進入細胞后促進GSH的產生，GSH可直接清除ROS，減少H202的生成[26]。β-谷氨酸-半胱氨酸連接酶是細胞內GSH生物合成中產生谷氨酰半胱氨酸的限速酶，Ozaras等證明，NAC通過提高細胞內β-谷氨酸-半胱氨酸連接酶活性、升高GSH保護肝臟免受氧化應激損傷[27]。因此，在本研究中輻射暴露后由于GSH參與了ROS的消除，所以GSH快速消耗。而NAC治療可逆轉氧化應激過程中GSH的耗竭和自由基的形成[28]。此外，SOD也是一種重要的抗氧化酶，電離輻射和許多氧化還原化學物可在短時間內使細胞內產生大量的O2·-，O2·-的過量產生可導致廣泛的擴散損傷[29]。SOD可將O2·-分解為H20和氧分子，是抵抗細胞和組織中O2·-的第一道防線，也被認為是防止由ROS和脂質過氧化引起損傷的主要防線[30]。NAC處理可提高細胞內SOD的活性，從而增強細胞的抗氧化能力[23]。與本實驗結果相符。

細胞凋亡是一種“程序性細胞死亡”，Bcl-2 家族是調控凋亡的重要基因家族，主要參與線粒體途徑介導的凋亡[31]。其中促凋亡蛋白 Bax與抗凋亡蛋白 Bcl-2 的比例是決定細胞是否發生凋亡的重要因素[32]。當Bax/Bcl-2比例增高時，促進細胞色素C(cytochrome C, Cyt-C)的釋放和半胱天冬酶的激活[33]。半胱天冬酶是參與凋亡的最重要的酶，其水解細胞的重要結構和功能蛋白，最終導致細胞凋亡。半胱天冬酶在細胞中為無活性的酶原，需要被激活才能發揮作用。當受到輻射后，細胞內ROS過量積聚，ROS的產生也被證明可以釋放Cyt-C，激活caspase級聯通路，進而導致細胞凋亡[34-35]。Mansour等發現，輻射暴露后HepG2細胞內MDA水平的顯著增加且伴隨caspase-3的激活[36]。Li等表明[37]，輻射引起大鼠海馬組織損傷是通過ROS的產生來介導的，表現為caspase-3水平升高，均證明氧化應激在輻射誘導的組織損傷中的作用。而NAC可通過阻止caspase-3的活化，阻止細胞凋亡的下游信號傳導[38]。在本實驗中NAC預處理通過阻止caspase-3的活化，減少輻射誘導的神經元凋亡。

綜上所述，NAC可通過抑制輻射后神經元細胞的氧化應激減少細胞內凋亡蛋白的含量，從而減少細胞凋亡。因此NAC可能是未來治療輻射相關認知功能障礙的潛在治療手段。