逆轉(zhuǎn)素對膽管結(jié)扎誘導(dǎo)大鼠肝損害的影響

黃 迪 黃 宇 黃子圣 翁杰鋒 李佩霖 張 帥 古維立

1 廣州市第一人民醫(yī)院普通外科(廣州 510180)2 華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院普通外科(廣州 510180)3 廣州消化疾病中心(廣州 510180)

膽汁淤積性肝病，是臨床上常見的肝臟疾病，其病因往往是由各種原因引起的膽汁生成、分泌和排泄障礙，從而引起的一系列器質(zhì)性損害、代謝失調(diào)和功能紊亂的肝膽系統(tǒng)疾病。膽汁淤積會導(dǎo)致膽紅素、膽汁酸鹽等成份分泌和排泄障礙。在臨床上各種肝病如急性肝炎，原發(fā)性膽汁性肝硬化及膽道疾病如膽結(jié)石，阻塞性黃疸，原發(fā)性硬化性膽管炎等都會常導(dǎo)致肝臟膽汁淤積[1]。膽汁從肝細(xì)胞分泌出來到腸道的排泄阻塞會導(dǎo)致肝臟組織中的膽汁酸積累，從而導(dǎo)致膽汁內(nèi)的成分誘導(dǎo)肝臟組織產(chǎn)生氧化應(yīng)激，炎癥，細(xì)胞凋亡和纖維化，最終發(fā)展為肝硬化。熊去氧膽酸(UDCA) 與奧貝膽酸(OCA) 聯(lián)合用藥是迄今為止唯一批準(zhǔn)的治療慢性膽汁淤積性肝病的方法[2]。但奧貝膽酸的價(jià)格昂貴，患者往往因長期用藥負(fù)擔(dān)不起，因此，急需開發(fā)治療膽汁淤積肝病新型藥物。

逆轉(zhuǎn)素 (Reversine) 是一種人工合成的小分子藥物，具有返老還童的作用，主要應(yīng)用在細(xì)胞去分化，研究小分子藥物對腫瘤的作用等[3]。我們前期研究已證實(shí)逆轉(zhuǎn)素能降解細(xì)胞外基質(zhì)并抑制 HSC 細(xì)胞的 TGF-β1通路的激活從而改善肝纖維化[4]且不影響正常肝臟的功能[5]。然而，目前尚不清楚逆轉(zhuǎn)素是否對膽汁淤積性肝損傷有保護(hù)作用。本研究通過膽管結(jié)扎(BDL)模擬小鼠膽汁淤積性肝損傷模型，探討逆轉(zhuǎn)素對大鼠膽管結(jié)扎所致的膽汁淤積性肝損害、纖維化、膽管反應(yīng)是否具有調(diào)節(jié)保護(hù)作用，為膽汁淤積性肝病的治療開發(fā)新型治療藥物。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及試劑

lewis雄性大鼠15只，體質(zhì)量180～220 g，購自廣東省實(shí)驗(yàn)動物中心。逆轉(zhuǎn)素(reversine，C21H27N7O，型號656820- 32- 5，分子量393.5 g/mol)購自Sigma公司。一次抗體試劑均購于Abcam公司。實(shí)驗(yàn)過程符合 《中華人民共和國實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》、《廣州市第一人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室動物管理?xiàng)l例》及倫理要求。

1.2 動物分組與處理

大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)組、膽管結(jié)扎(BDL)組、以及BDL同時(shí)逆轉(zhuǎn)素處理(BDL+Rev)組，每組各5只。對于BDL組大鼠，吸入異氟醚麻醉后開腹，露出膽總管，用不可吸收的6- 0單絲縫線結(jié)扎2次。腹部用5- 0多層編織絲線縫合，時(shí)長2周。對于BDL+Rev組，膽管結(jié)扎同BDL組處理，于手術(shù)第2天腹腔注射一次逆轉(zhuǎn)素(200 μg/kg)，然后每3天給藥一次，時(shí)長2周。對于Sham組，手術(shù)過程同BDL組但不予膽管結(jié)扎處理。2周后處死大鼠，通過下腔靜脈采集血液樣本以及右肝組織樣品。血液樣品于4 ℃ 1 600 g離心10分鐘，血漿于- 80 ℃保存至化驗(yàn)。肝組織樣本應(yīng)用4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定進(jìn)行組織學(xué)分析。

1.3 肝血清學(xué)指標(biāo)檢測

肝血指標(biāo)包括總白蛋白(TP)、總膽紅素(TBIL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)，檢測應(yīng)用全自動生化發(fā)光免疫分析儀 Maglumi2000 完成。

1.4 H&E 和 Azan染色

石蠟切片脫蠟復(fù)水，經(jīng) H&E、Azan染色后，脫水、透明，中性樹脂封片。染 色玻片于 Olympus IX51 倒置顯微鏡下觀察，每張玻片任選 5～10 個(gè)視野進(jìn)行低高倍鏡拍照保存。

1.5 肝組織免疫組化

切片常規(guī)脫蠟復(fù)水，應(yīng)用常規(guī)免疫組化 SP法檢測anti-Desmin (1:200, ab15200)，anti-Vimentin (1:500, ab8069)，anti-aSMA (1:200, ab7817)，anti-CK7 (1:8000, ab181598)，anti-CK19 (1:200, ab7755)，anti-EpCAM (1:200, ab71916)， anti-β-catenin (1:500, ab32572)蛋白的表達(dá)。以出現(xiàn)棕黃色或褐色作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。玻片于 Olympus IX51 倒置相差顯微鏡下觀察，每張玻片任選 5～10 個(gè)視野進(jìn)行低高倍鏡拍照保存，采用 WinROOF圖像分析軟件測定染色陽性區(qū)域累積面積和整個(gè)組織的面積比值作為相對表達(dá)含量的測定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用 Prism8 統(tǒng)計(jì)軟件作圖分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料，多組間比較采用 單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey法計(jì)算，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 逆轉(zhuǎn)素(Rev)對膽管結(jié)扎(BDL)大鼠血清學(xué)標(biāo)記物的影響

2 結(jié) 果

2.1 逆轉(zhuǎn)素對膽管結(jié)扎大鼠血清學(xué)標(biāo)記物的影響

通過檢測總白蛋白(TP)、總膽紅素(TBIL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)在各組的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)(圖1)，膽管結(jié)扎2周對大鼠造成嚴(yán)重?fù)p害，表現(xiàn)為，肝臟合成的總白蛋白量下降(F=7.733，P=0.004 1)，總膽紅素(TBIL，F(xiàn)=44.80，P<0.000 1)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST，F(xiàn)=41.48，P<0.000 1)、堿性磷酸酶(ALP，F(xiàn)=7.117，P=0.008 2)、γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT，F(xiàn)=15.92，P=0.000 2)水平明顯上升，對谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT，F(xiàn)=2.405，P=0.126 6)影響不大。而同時(shí)給予逆轉(zhuǎn)素處理則對肝臟具有保護(hù)作用，表現(xiàn)為逆轉(zhuǎn)素使下降的總白蛋白上升，使上升的總膽紅素、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶水平向正常水平回復(fù)。這說明逆轉(zhuǎn)素對機(jī)體肝臟膽汁淤積具有一定的調(diào)節(jié)作用。

2.2 逆轉(zhuǎn)素對膽管結(jié)扎大鼠肝組織的影響

通過觀察各組中肝臟整體組織可以發(fā)現(xiàn)(圖2A)，正常對照組肝臟表面光滑，邊緣整齊，顏色鮮艷，質(zhì)地均勻。膽管結(jié)扎組肝臟表面粗糙，顏色偏黃，質(zhì)地較硬，有顆粒感。逆轉(zhuǎn)素處理組肝臟的顏色質(zhì)地則處于正常組和膽管結(jié)扎組之間，且接近正常組表象。通過H&E染色肝臟實(shí)質(zhì)發(fā)現(xiàn)(圖2B，2C)，正常組肝臟組織細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整，膽管結(jié)扎組肝組織出現(xiàn)大量的炎癥細(xì)胞浸潤，結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂，出現(xiàn)大量的增生細(xì)胞。逆轉(zhuǎn)素處理組肝組織則表現(xiàn)為輕度的炎性細(xì)胞浸潤較膽管狀結(jié)扎減少，結(jié)構(gòu)紊亂情況叫膽管結(jié)扎好轉(zhuǎn)。說明逆轉(zhuǎn)素對肝組織的保護(hù)作用。

圖2 逆轉(zhuǎn)素(Rev)對膽管結(jié)扎(BDL)大鼠肝組織的影響。注：A：各處理中肝臟大體圖像；B：低倍顯微鏡下各組肝組織的H&E染色圖像；C：高倍顯微鏡下各組肝組織H&E染色圖像。

2.3 逆轉(zhuǎn)素對膽管結(jié)扎大鼠肝組織纖維化的影響

為了探究逆轉(zhuǎn)素對膽管結(jié)扎大鼠肝組織纖維化的影響，首先通過Azan染色法檢測了各組肝組織中的膠原蛋白的情況(圖3A)。結(jié)果顯示正常肝臟中膠原蛋白主要位于中央靜脈肝動靜脈周圍，然膽汁淤積導(dǎo)致肝臟實(shí)質(zhì)明顯沉積大量膠原蛋白。逆轉(zhuǎn)素處理組則表明為肝臟實(shí)質(zhì)沉積的膠原蛋白較膽管結(jié)扎組明顯降低。同時(shí)通過免疫組化法檢測肝星狀細(xì)胞活化標(biāo)記物α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)，結(jié)果顯示(圖3B)在正常肝組織中α-SMA主要位于肝匯管區(qū)的周圍，而膽管結(jié)扎肝組織則表現(xiàn)為肝實(shí)質(zhì)中α-SMA大量沉積。逆轉(zhuǎn)素處理后，肝臟組織沉寂的α-SMA則明顯較膽管結(jié)扎肝組織減少。同時(shí)通過相對組織定量發(fā)現(xiàn)(圖3C)，逆轉(zhuǎn)素明顯降低由膽汁淤積導(dǎo)致的膠原蛋白(F=63.16，P<0.000 1)和α-SMA蛋白(F=87.00，P<0.000 1)的在肝實(shí)質(zhì)中的表達(dá)，接近正常組表達(dá)水平，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明逆轉(zhuǎn)素可以緩解膽汁淤積引起的肝纖維化。

圖3 逆轉(zhuǎn)素(Rev)對膽管結(jié)扎(BDL)大鼠肝組織纖維化的影響注：A：Azan染色各組肝組織中膠原蛋白(呈藍(lán)色)的圖像；B：免疫組化檢測各組肝組織中α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達(dá)情況；C：Azan染色膠原蛋白和平滑肌肌動蛋白在各組肝組織中的陽性比率。

2.4 逆轉(zhuǎn)素對膽管結(jié)扎大鼠肝組織EMT的影響

為了探究逆轉(zhuǎn)素對膽管結(jié)扎大鼠肝組織上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響。我們利用免疫組化法檢測了各組肝組織中間質(zhì)細(xì)胞表型標(biāo)記蛋白，結(jié)蛋白(Desmin，圖4A)以及波形蛋白(Vimentin，圖4B)的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膽管結(jié)扎可以明顯增加肝臟實(shí)質(zhì)中結(jié)蛋白和波形蛋白的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)素處理則可以明顯減少結(jié)蛋白和波形蛋白的表達(dá)。同時(shí)通過相對組織定量發(fā)現(xiàn)(圖4C)，逆轉(zhuǎn)素明顯降低由膽汁淤積導(dǎo)致的結(jié)蛋白(F=50.99，P<0.000 1)和波形蛋白(F=49.33，P<0.000 1)的在肝實(shí)質(zhì)中的表達(dá)，可接近正常組表達(dá)水平，說明逆轉(zhuǎn)素可以抑制膽汁淤積引起的EMT。

圖4 逆轉(zhuǎn)素(Rev)對膽管結(jié)扎(BDL)大鼠肝組織EMT的影響注：A：免疫組化檢測各組肝組織中結(jié)蛋白(Desmin)的表達(dá)情況；B：免疫組化檢測各組肝組織中波形蛋白(Vimentin)的表達(dá)情況；C：間質(zhì)細(xì)胞表型蛋白Desmin和Vimentin蛋白在各組肝組織中的陽性比率。

2.5 逆轉(zhuǎn)素對膽管結(jié)扎大鼠肝組織膽管反應(yīng)的影響

接下來，我們探究了逆轉(zhuǎn)素對膽管結(jié)扎大鼠肝組織膽管反應(yīng)的影響。我們利用免疫組化法檢測了各組肝組織中膽管反應(yīng)標(biāo)記蛋白，細(xì)胞角蛋白CK7(圖5A)和CK9(圖5B)陽性膽管細(xì)胞的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膽管結(jié)扎可以明顯增加肝臟實(shí)質(zhì)中細(xì)胞角蛋白CK7和CK19陽性膽管細(xì)胞的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)素處理則可以明顯減少CK7和CK19陽性膽管的表達(dá)。同時(shí)通過相對組織定量發(fā)現(xiàn)(圖5C)，逆轉(zhuǎn)素明顯降低由膽汁淤積導(dǎo)致的CK7(F=94.90，P<0.000 1)和CK19(F=158.9，P<0.000 1)陽性膽管細(xì)胞的在肝實(shí)質(zhì)中的表達(dá)量，說明逆轉(zhuǎn)素可以抑制膽汁淤積引起的膽管反應(yīng)。

圖5 逆轉(zhuǎn)素(Rev)對膽管結(jié)扎(BDL)大鼠肝組織膽管反應(yīng)的影響注：A：免疫組化檢測各組肝組織中細(xì)胞角蛋白7(CK7)的表達(dá)情況；B：免疫組化檢測各組肝組織中細(xì)胞角蛋白19(CK19)的表達(dá)情況；C：膽管反應(yīng)蛋白標(biāo)記CK7和CK9在各組肝組織中的陽性比率。

2.6 逆轉(zhuǎn)素對膽管結(jié)扎大鼠肝組織膽管上皮標(biāo)記蛋白的影響

為了進(jìn)一步探究逆轉(zhuǎn)素對膽管結(jié)扎引起的膽管反應(yīng)的調(diào)節(jié)，我們用免疫組化法檢測了各組肝組織中β-連環(huán)蛋白(β-Catenin，圖6A)和上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)蛋白(圖6B)的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，β-連環(huán)蛋白(β-Catenin)和上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)同樣地在增生明顯的膽管細(xì)胞中表達(dá)，較正常肝組織表達(dá)量明顯增加。逆轉(zhuǎn)素處理后，β-Catenin和EpCAM陽性的膽管細(xì)胞較膽管結(jié)扎肝組織明顯減少。相對組織定量發(fā)現(xiàn)(圖6C)，逆轉(zhuǎn)素明顯降低由膽汁淤積導(dǎo)致的β-Catenin(F=73.49，P<0.000 1)和EpCAM(F=115.6，P<0.000 1)陽性膽管細(xì)胞的在肝實(shí)質(zhì)中的表達(dá)量，說明逆轉(zhuǎn)素可以抑制膽汁淤積引起的膽管反應(yīng)與調(diào)節(jié)β-Catenin和EpCAM的表達(dá)有關(guān)。

圖6 逆轉(zhuǎn)素(Rev)對膽管結(jié)扎(BDL)大鼠肝組織膽管上皮標(biāo)記蛋白的影響注：A：免疫組化檢測各組肝組織中β-連環(huán)蛋白(β-Catenin)的表達(dá)情況；B：免疫組化檢測各組肝組織中上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)蛋白的表達(dá)情況；C：膽管上皮標(biāo)記蛋白β-Catenin 和EpCAM在各組肝組織中的陽性比率。

3 討 論

膽汁淤積性肝損傷是慢性肝病患者肝纖維化和肝硬化發(fā)展的主要致病因素之一，臨床上已經(jīng)獲批的治療藥物十分有限，治療藥物基本分為熊去氧膽酸、激素類及中醫(yī)中藥類，但治療費(fèi)用昂貴且療效有限。為了評估逆轉(zhuǎn)素對膽汁淤積性肝損傷的影響，我們使用 BDL 作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停l(fā)現(xiàn)了：①補(bǔ)充逆轉(zhuǎn)素可以緩解膽汁淤積引起的肝纖維化，表現(xiàn)為下調(diào)BDL引起的膠原蛋白和α-SMA蛋白沉積。②逆轉(zhuǎn)素可以抑制膽汁淤積引起的上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)為逆轉(zhuǎn)素明顯降低BDL導(dǎo)致的Desmin和Vimentin的表達(dá)。③逆轉(zhuǎn)素可以抑制膽汁淤積引起的膽管反應(yīng)，表現(xiàn)為逆轉(zhuǎn)素明顯減少CK7和CK19陽性膽管的表達(dá)含量。并且，逆轉(zhuǎn)素抑制膽汁淤積引起的膽管反應(yīng)與調(diào)節(jié)β-Catenin和EpCAM的表達(dá)有關(guān)。

逆轉(zhuǎn)素是一種人工合成的小分子藥物，可以令已分化的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槲捶只?xì)胞。我們前期的研究[4,6]表明，在藥物誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型中逆轉(zhuǎn)素可減少細(xì)胞外基質(zhì)并抑制 HSC 細(xì)胞的TGF-β通路的激活，從而改善肝纖維化，且不影響正常肝臟的功能[5]。同時(shí)逆轉(zhuǎn)素在逆轉(zhuǎn)肝臟衰老等方面表現(xiàn)出一定的應(yīng)用價(jià)值[5]。膽汁淤積性肝病是由于膽汁排泄障礙、膽汁流量減少、膽汁成分返流入血液中而引起的一系列肝病。BDL模型中結(jié)扎膽總管后，隨時(shí)間延長肝臟對稱性腫大，出現(xiàn)膽汁淤積表現(xiàn)。此模型造模方法簡單、周期短，形成膽汁淤積穩(wěn)定可靠，是研究膽汁淤積病機(jī)制和尋找治療藥物研究的理想模型[7]。在我們的研究中，膽管結(jié)扎兩周引起大鼠肝臟損害表現(xiàn)為肝酶升高，主要是谷草轉(zhuǎn)氨酶，同時(shí)引起膽汁淤積的血清學(xué)改變?nèi)缈偰懠t素、堿性磷酸酶、γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶顯著上升。膽色素在肝細(xì)胞組織中蓄積，引起肝臟器質(zhì)性受到損害，導(dǎo)致代謝紊亂和肝臟功能異常，進(jìn)一步發(fā)展將導(dǎo)致肝小葉和肝臟組織內(nèi)血管結(jié)構(gòu)破壞、結(jié)締組織橋接形成等。本實(shí)驗(yàn)中體現(xiàn)在肝實(shí)質(zhì)中膠原蛋白增多，肝星狀細(xì)胞活化增加。

上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程[8]。EMT在多種纖維化疾病特別是肝纖維化中發(fā)揮了重要作用[9]。在BDL誘導(dǎo)膽汁淤積模型中，我們發(fā)現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞表型蛋白Desmin和波形蛋白Vimentin在肝實(shí)質(zhì)中表達(dá)增加，說明膽汁淤積可以誘發(fā)EMT，這也許是長期膽汁淤積得不到改善引起肝纖維化甚至肝硬化的源頭。而逆轉(zhuǎn)素處理后，會緩解肝臟實(shí)質(zhì)EMT的情況，這也許是逆轉(zhuǎn)素抑制惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要相關(guān)機(jī)制。我們猜測逆轉(zhuǎn)素對BDL引起的肝癌膽管癌有一定的抑制效果，但仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

膽汁淤積初期，膽紅素淤積肝組織引起炎癥改變，肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞的反應(yīng)性變化。一方面引起肝纖維化和上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，另一方面也會引起膽管反應(yīng)細(xì)胞增生。反應(yīng)性膽管細(xì)胞增殖，也稱為ductular reaction (DR)。這一點(diǎn)也在本實(shí)驗(yàn)中，在BDL誘導(dǎo)的膽汁淤積性肝病中得到證實(shí)。在我們的研究中，BDL誘導(dǎo)的DR表現(xiàn)出一定的共同特征。一方面，BDL誘導(dǎo)的DR出現(xiàn)在大的膽管周圍，這一點(diǎn)也在BDL誘導(dǎo)的小鼠肝臟中有報(bào)道[7]。另一方面，BDL誘導(dǎo)的DR不僅出現(xiàn)在小的門管區(qū)，也出現(xiàn)在遠(yuǎn)離門管區(qū)的肝實(shí)質(zhì)區(qū)域。換言之，BDL可導(dǎo)致膽管中存在的膽管細(xì)胞增殖，定義為典型的膽管[10]，同樣地，BDL還可引起無膽管細(xì)胞的肝細(xì)胞區(qū)域膽管細(xì)胞轉(zhuǎn)化，稱為非典型導(dǎo)管[10]。據(jù)報(bào)道，DR細(xì)胞可能起源于膽管細(xì)胞、肝細(xì)胞和肝祖細(xì)胞[11]。目前認(rèn)為，DR是肝細(xì)胞受損后的機(jī)體自身防御性反應(yīng)，說明肝細(xì)胞受到一定的損害[11]。本實(shí)驗(yàn)中，逆轉(zhuǎn)素處理后，DR反應(yīng)減弱，說明肝臟處于恢復(fù)階段，從而也在一定程度上說明了逆轉(zhuǎn)素通過調(diào)節(jié)膽管反應(yīng)保護(hù)肝臟的作用。

綜上所述，本研究利用模擬臨床狀態(tài)下膽汁淤積性肝損傷大鼠模型，表明逆轉(zhuǎn)素可以緩解膽汁淤積引起的大鼠肝損害，具有一定的保護(hù)作用。逆轉(zhuǎn)素有可能開發(fā)成為延緩治療膽汁淤積性疾病的藥物，但尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來證明。