芪地糖腎方對高糖誘導足細胞自噬相關因子表達的影響

王琳 趙麗 魏慧麗 趙俊峰 安志超 謝惠迪 郭燕 宿家銘 柳紅芳

(1北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700；2河南省中醫院)

糖尿病腎臟病(DKD)是全球導致終末期腎病的主因〔1〕，其治療以降低尿蛋白為主，而足細胞損傷引起的蛋白尿是DKD進展的關鍵。芪地糖腎方(QDTS)(專利號：201711097315.2)由北京中醫藥大學東直門醫院柳紅芳教授依據明代醫家張介賓“真陰精氣”學說為理論基礎并結合多年臨床經驗擬創而成〔2〕。QDTS針對DKD 蛋白尿的臨床療效頗佳〔3,4〕。研究證明QDTS可激活db/db小鼠腎臟自噬相關營養感知信號通路，調控自噬相關蛋白LC3Ⅱ、P62、Beclin1等表達起到保護小鼠腎臟的作用〔5,6〕，本研究探討QDTS對高糖誘導足細胞自噬相關因子表達的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 實驗藥物：QDTS凍干粉(原藥材購自北京中醫藥大學東直門醫院)。實驗細胞：小鼠足細胞MPC5(東直門實驗室劉偉敬老師團隊饋贈)。主要試劑和儀器：TRYPSIN 0.25%乙二胺四乙酸(EDTA、DMEM細胞培養基(無糖)、胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液購自Invitrogen公司；二甲基亞砜(DMSO)購自SIGMA公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)購自美國Solarbio公司；蛋白提取放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑、蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)均購自Solarbio公司；移液器購自Eppendorf；兔多克隆抗體兔抗鼠LC3Ⅱ、P62、SIRT1一抗購自Abcam公司；電化學發光(ECL)顯影劑購自Biorad；蛋白上樣緩沖液購自普利萊。其他生化試劑：無水乙醇、氯仿、異丙醇、多聚甲醛、過硫酸銨(APC)、水等均由北京中醫藥大學附屬東直門醫院實驗中心提供。HDL潔凈工作臺：北京東聯哈爾儀器制造有限公司；CO2恒溫培養箱：Thermo公司；臺式低溫高速離心機：3K15型，德國Sigma公司；渦旋機：QL-861，Qilinbeibr；細胞刮刀：購自Corning；自動超純水蒸饋器：Milli-Q型，Integral公司；光譜掃描多功能酶標儀：Promega公司；倒置相差顯微鏡購自Olympus公司；電泳儀購自Biorad公司。

1.2實驗分組 體外培養小鼠足細胞MPC5，葡萄糖35 mmol/L干預48 h成功建立高糖誘導足細胞模型，分為空白對照組(正常足細胞)、高糖模型組、QDTS低、中、高劑量組(中藥凍干粉分別為0.1、0.2、0.4 mg/ml)。

1.3細胞培養 取出細胞凍存管，于37℃水浴鍋中融化，1 000 r/min室溫離心5 min，棄凍存液用完全培養基洗滌，離心重懸后轉移至細胞培養瓶，置33℃、5%CO2恒溫箱增殖培養2～3 d，轉移至37℃、5%CO2分化。細胞計數：制備單個細胞懸液，在細胞計數板中央放置計數專用的蓋玻片，細胞懸液吹打均勻后轉移EP管中，沿蓋玻片邊緣加入，置顯微鏡計數四角大方格內的細胞總數，細胞密度=(4個大格子細胞總數/4)×104個/ml。

1.4細胞免疫熒光染色 12孔板細胞爬片分組培養至其生長融合到70%～80%，PBS洗3遍；4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS洗3遍；0.2%Triton X-100通透5 min，PBS洗3遍；5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉30 min；一抗濕盒4℃內過夜，PBS洗3遍，二抗室溫2 h(避光)，PBS洗3遍；4',6'-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染細胞核：在避光的條件下，加入用PBS稀釋5 000倍的1 μg/ml DAPI，在室溫下放置5 min，然后使用預冷的1‰ Tween清洗2次，每次清洗5 min，繼而用預冷PBS洗5 min，蒸餾水洗掉PBS，95%甘油封片。免疫熒光分析：圖中柔和的小亮點即目的蛋白的具體表達部位，3位病理從業者獨立對其進行了盲法評分，根據數量從最小到最大分為5個層次。

1.5Western印跡蛋白提取 PBS清洗，加入蛋白裂解液(RIPA+蛋白酶抑制劑)，細胞刮刀刮下細胞移至離心管，4℃、3 000 r/min、5 min離心。蛋白定量(Solarbio BCA蛋白濃度測定試劑盒)96孔板設標準品、樣品、設2個復孔；每孔200 μl BCA工作液；稀釋待測樣品至合適濃度，總體積20 μl，BCA工作液200 μl、37℃、30 min、酶標儀562 nm波長，記錄OD值；5×蛋白上樣緩沖液加入混勻后，100℃，水浴10 min。配分離膠(H2O、30%Acr-Bis、分離膠緩沖液、10%APS、TEMED)，配濃縮膠(H2O、30%Acr-Bis、分離膠緩沖液、10%APS、TEMED)，加TEMED后，將孔梳插入濃縮膠后置入電泳槽，加電泳液(Tris-甘氨酸緩沖液 SDS)，拔出梳子，加樣，Mark，按上樣質量為20 μg的體積加入電泳道內；電泳100 V、1.5 h分離膠；80 V濃縮膠；NC膜浸潤甲醇中15 s活化，將聚偏氟乙烯(PVDF)膜、濾紙浸入1×電轉移液中(Tris、甘氨酸、甲醇)半干轉15 V 1.5 h；TBST洗，5%脫脂奶粉(2 g脫脂奶粉+4 ml TBST混勻)封閉后TBS清洗，孵育一抗LC3Ⅱ、P62、SIRT1、β-actin 4℃過夜；TBS洗7次，5 min/次，二抗羊抗鼠1.5 h，顯色。

1.6統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行ANOVA單因素方差分析、Welch檢驗、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1QDTS對高糖刺激足細胞MPC5自噬相關蛋白表達影響 與空白對照組比較，高糖模型組LC3Ⅱ、SIRT1表達顯著降低，P62表達顯著升高(均P<0.01);與高糖模型組比較，QDTS低、中、高各劑量組LC3Ⅱ、SIRT1表達均顯著升高，P62表達均顯著降低(均P<0.001)。見圖1、表1。

2.2QDTS對高糖刺激足細胞MPC5 LC3Ⅱ、P62免疫熒光表達影響 與空白對照組比較，高糖模型組P62表達顯著升高,而LC3Ⅱ表達顯著降低(P<0.001)；與高糖模型組比較，QDTS低、中、高各劑量組LC3Ⅱ表達顯著升高，P62表達顯著降低(均P<0.001)。見表1、圖2。

1～5:空白對照組，高糖模型組，QDTS低劑量組，QDTS中劑量組，QDTS高劑量組圖1 各組MPCS細胞SIRT1、P62、LC3Ⅱ蛋白表達

表1 各組MPC5細胞SIRT1、P62、LC3Ⅱ蛋白相對表達量比較

圖2 QDTS刺激高糖足細胞LC3Ⅱ、P62免疫熒光蛋白表達(DAPI，×100)

3 討 論

DKD是以虛實夾雜、氣陰兩虛為病機基礎，日久耗氣傷陰至肝腎不足，陰陽兩虛，脾腎陽虛的疾病〔7〕。中醫治療應分清標本緩急，早期重在扭轉病勢，中后期重在延緩病情進程〔8〕。糖尿病無腎臟疾病階段，氣陰兩虛為主要病機，伴隨疾病的發展導致人體陰精虧損，腎藏精，逐漸形成腎精虧損的癥狀，多體現為蛋白尿陽性。腎臟精氣虧損無力推動血脈運行致血流不暢、脈絡痹阻〔9〕。柳紅芳教授根據長期臨床經驗結合當前DKD相關三焦失用說、脾失健運說、微型徵瘕說、毒損腎絡等學說提出DKD的核心病機為精損絡痹，以填精通絡為治療法則，并擬QDTS(黃芪、熟地、芡實、水蛭、大黃等)〔10〕，經臨床和體內實驗驗證療效顯著〔3，11，12〕。DKD初期以間歇性蛋白尿為主，隨著病情發展出現持續性蛋白尿、低蛋白血癥等最終導致腎病綜合征、慢性腎衰竭并死于尿毒癥，因此，有效控制蛋白尿的發生發展是DKD治療的關鍵因素〔13，14〕。足細胞是一種過濾血液、阻止血漿蛋白進入尿濾液的特殊腎小球細胞，是腎小球濾膜的基本組成部分，其形成的狹縫隔膜對維持腎小球的完整性和功能至關重要，其密度降低及功能損傷可引起蛋白尿、小管間質病變，并最終發展為終末期腎病〔15，16〕，足細胞功能改變是蛋白尿發生發展的重要影響因子〔17〕。自噬是足細胞、近端小管、系膜和內皮細胞的重要保護機制，調控足細胞自噬可改變DKD發生發展〔18，19〕。高水平的葡萄糖會造成足細胞損傷，但很少報道高濃度葡萄糖和細胞自噬之間的關系，研究表明，高糖可促進足細胞的自噬，細胞內出現需要自噬作用清除的毒性物質時，LC3首先被裂解為LC3Ⅰ，然后再經過磷脂酰乙醇胺加工修飾而轉變為LC3Ⅱ，然后再被募集到自噬體膜上，所以LC3Ⅱ也被公認為是細胞內自噬活性的早期標志蛋白〔20〕；SIRT1激動劑白藜蘆醇能夠增強SIRT1表達，改善胰島素抵抗，降低血糖，促進線粒體再生，還能減輕系膜細胞增生，改善足細胞損傷，增強腎臟自噬活性和減輕炎癥及減輕腎臟內氧化壓力等多個途徑發揮治療DKD的作用〔21，22〕。本研究提示中藥QDTS上調了自噬相關蛋白LC3Ⅱ、SIRT1表達，同時減少了自噬轉運底物P62的蓄積，與db/db小鼠體內實驗基本一致。本研究表明QDTS對db/db小鼠具有不依賴血糖控制的腎保護作用,可能歸因于自噬相關營養感知信號的調節〔5〕，該研究從體外實驗初步探討驗證相關結論，但仍需深入研究其相關作用機制和靶點。