上調(diào)SERCA2a基因?qū)β孕牧λソ叽笫蟮淖饔眉皺C(jī)制

陳磊 吳小燕

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，海南 海口 570100)

慢性心力衰竭是多種心臟疾病終末狀態(tài)，當(dāng)心肌細(xì)胞發(fā)生衰竭后會導(dǎo)致多種生物過程發(fā)生改變，其中較為重要的表現(xiàn)之一為肌漿網(wǎng)Ca2+調(diào)控障礙〔1〕。已有研究證實(shí)在心力衰竭患者和心力衰竭動物模型的心肌細(xì)胞中心肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶(SERCA)2a活性顯著降低，且其表達(dá)水平顯著低于在正常心肌細(xì)胞中的表達(dá)，目前臨床上認(rèn)為SERCA2a活性降低和表達(dá)下降和肌漿網(wǎng)Ca2+調(diào)控障礙是導(dǎo)致心臟收縮、舒張功能異常的原因之一〔2,3〕。本研究中通過建立慢性心力衰竭大鼠模型，構(gòu)建SERCA2a基因慢病毒載體，研究上調(diào)SERCA2a基因?qū)β孕牧λソ叽笫蟮淖饔眉皺C(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 研究動物：選取SPF級SD健康大鼠40只，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，鼠齡(3.9±0.6)個月，體重(225.8±11.5)g。所有大鼠均養(yǎng)殖在干凈籠子里，室溫在(22.1±1.8)℃，相對濕度35%～40%，每天光照12 h，喂飲純凈水，飼養(yǎng)時間1 w。本研究所做實(shí)驗(yàn)均獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

主要試劑：小鼠抗大鼠PLB抗體(上海優(yōu)寧維生物科技有限公司)，小鼠抗大鼠GRP78抗體(廣州市格瑞林生物科技有限公司)，兔抗大鼠p-JNK抗體(SANTA CRUZ公司)，兔抗人Caspase-12抗體(Abcam公司)。

1.2方法

1.2.1慢病毒載體構(gòu)建 SERCA2a表達(dá)上調(diào)的慢病毒載體構(gòu)建及測定大鼠SERCA2a的序列查找和設(shè)計由廣州易錦公司完成。重組的LV-SERCA2a和LV-SERCA2a(抑制載體)慢病毒表達(dá)載體由廣州易錦公司合成，并經(jīng)測序進(jìn)行驗(yàn)證。之后行慢病毒滴度測定，制備完成后重組慢病毒在-80℃下保存。

1.2.2建模 隨機(jī)選取40只小鼠中的10只作為正常組，另外30只小鼠建立參照Ahemed等〔4〕研究實(shí)驗(yàn)中腹腔注射阿霉素的方法建立慢性心力衰竭大鼠模型，將阿霉素配制成2 mg/ml的溶液連續(xù)6 w注射于大鼠腹腔(4 mg/kg)，使用10%水合氯醛注射于大鼠腹腔進(jìn)行麻醉處理，之后使得大鼠仰臥在操作臺上，并作固定，剃除大鼠胸前區(qū)毛發(fā)，測定心臟左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)，當(dāng)LVEF<60%時則表示慢性心力衰竭大鼠模型建立成功。將建模成功的30只慢性心力衰竭大鼠隨機(jī)分為模型組、下調(diào)組、上調(diào)組各10只。在建模成功后，將10 μl重組的LV-SERCA2a慢病毒懸液(病毒滴度為108TU/ml)在無菌環(huán)境下注射至上調(diào)組大鼠心臟中，將10 μl LV-SERCA2a(抑制載體)慢病毒懸液(病毒滴度為108TU/ml)在無菌環(huán)境下注射至下調(diào)組大鼠心臟中，正常組、模型組大鼠不做任何處理。

1.2.3樣本采集 采用斷頭法處死，立即取大鼠心肌組織，將提取的組織制作標(biāo)本，使用40 ml/L的多聚甲醛進(jìn)行固定，常溫下使用15%的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)脫鈣，脫水后進(jìn)行石蠟包埋，制作3 μm的組織切片，每組各7份心肌組織樣本。其中1份心肌組織樣本作病理組織學(xué)觀察；取其中4份心肌組織，剪碎放置于器皿中，之后將5 ml 25%的膠原酶Ⅱ加入，將心肌細(xì)胞分離出待用；另外2份作后續(xù)研究指標(biāo)檢測。

1.2.4病理組織學(xué)觀察 取1份心肌組織樣本后行蘇木素-伊紅(HE)染色處理，之后使用顯微鏡觀察大鼠心肌組織病理變化。

1.2.5心功能檢測 使用10%水合氯醛注射于各組剩余2只大鼠腹腔行麻醉處理，待麻醉后剃除大鼠局部毛發(fā)，使用高分辨率小動物超聲系統(tǒng)對四組大鼠左心室舒張、收縮末內(nèi)徑(LVEDD、LVESD)、LVEF及左心室短軸縮短率(FS)，測量連續(xù)完整的4個心動周期，取平均值。

1.2.6血流動力學(xué)檢測 在大鼠心功能檢測后，將右側(cè)頸動脈分離出，行氣管插管，之后氣管通過壓力傳感器和多導(dǎo)生理監(jiān)護(hù)儀相連接，當(dāng)波形穩(wěn)定后逆行將導(dǎo)管插入大鼠左心室，對四組大鼠左心室收縮、舒張末壓(LVESP、LVEDP)及左心室內(nèi)壓上升、下降速率(±dp/dt)。

1.2.7心肌細(xì)胞中Ca2+濃度檢測 取2份分離出的心肌細(xì)胞放置于溫度為37℃水中行水浴處理，之后使用鈣熒光染料(Fluo/AM)避光孵育，孵育時間為1 h，之后在轉(zhuǎn)速為3 000 r/min的離心機(jī)中離心處理1 min，去除負(fù)載液，并使用生理記錄液反復(fù)洗滌3次。使用激光共聚焦顯微鏡對形態(tài)完成、染色效果較好的細(xì)胞進(jìn)行掃描，心肌細(xì)胞中熒光值(鈣離子濃度)測定：激發(fā)波長為488 nm、發(fā)射波長為520 nm。之后使用計算機(jī)將圖像處理，得到細(xì)胞內(nèi)分布圖。最后經(jīng)過系統(tǒng)分析、換算出心肌細(xì)胞中Ca2+濃度。

1.2.8心肌細(xì)胞凋亡檢測 使用TUNEL法檢測大鼠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量，TUNEL陽性細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為細(xì)胞胞體變小，細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)凝聚，呈現(xiàn)為黃褐色或者黃色顆粒，出現(xiàn)明顯的為凋亡細(xì)胞凋亡特征。

1.2.9蛋白檢測 使用Western印跡檢測四組大鼠心肌組織中受磷蛋白(PLB)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP)78、凋亡蛋白CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白-磷酸化的c-Jun氨基末端激酶-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(CHOP-p-JNK-Caspase)-12通路蛋白表達(dá)量，將采集到的標(biāo)本，研磨后加入蛋白緩沖液，進(jìn)行常規(guī)蛋白提取，采取二喹啉甲酸(BCA)法進(jìn)行定量分析。50 μg的蛋白樣品上樣后十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，通過蛋白電轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，使用5%的脫脂奶粉TBST中進(jìn)行避光封閉1 h，洗滌之后加入一抗稀釋溶液(PLB、GRP78、CHOP、p-JNK、Caspase-12按照1∶1 000比例進(jìn)行稀釋)，在4℃的環(huán)境中過夜保存，洗滌后加入二抗稀釋溶液(PLB、GRP78、CHOP、p-JNK、Caspase-12按照1∶5 000比例進(jìn)行稀釋)，在溫床中孵育1 h后再次洗滌，加入電化學(xué)發(fā)光液，曝光2～3次，取重疊值。使用軟件分析蛋白條帶灰度值。設(shè)置內(nèi)參蛋白為是GAPDH。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行F檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠心肌病理組織學(xué)觀察 正常組大鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)清晰、排列整齊，可見有心肌細(xì)胞呈圓形，心肌無萎縮、壞死、炎細(xì)胞浸潤，病理分級為0級。模型組大鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)模糊，排列不規(guī)則、紊亂，出現(xiàn)心肌纖維萎縮、液化性溶解及斷裂等，細(xì)胞核固縮，心肌間質(zhì)可見有增生的結(jié)締組織和炎細(xì)胞浸潤，病理分級為Ⅱ級。下調(diào)組大鼠心肌結(jié)構(gòu)模糊，排列混亂，心肌出現(xiàn)萎縮、纖維化現(xiàn)象，心肌纖維斷裂，血管壁增厚，病理分級為Ⅱ～Ⅲ級。上調(diào)組大鼠心肌排列相比模型組和下調(diào)組稍微規(guī)整，無較為明顯可見的心肌萎縮、壞死等病理性改變，心肌間質(zhì)無水腫，但存在輕度的結(jié)締組織增生，病理分級為Ⅰ級。見圖1。

2.2各組心功能比較 與正常組相比，模型組、下調(diào)組、上調(diào)組大鼠LVEDD明顯升高，LVEDD、LVEF、FS明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，下調(diào)組大鼠LVEDD明顯升高，LVEDD、LVEF、FS明顯降低，上調(diào)組大鼠LVEDD明顯降低，LVEDD、LVEF、FS明顯升高(P<0.05)；與下調(diào)組相比，上調(diào)組大鼠LVEDD明顯降低，LVEDD、LVEF、FS明顯升高(P<0.05)。見表1。

2.3各組血流動力學(xué)比較 與正常組相比，模型組、下調(diào)組、上調(diào)組大鼠LVEDP明顯升高，LVESP、+dp/dt、-dp/dt明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，下調(diào)組大鼠LVEDP明顯升高，LVESP、+dp/dt、-dp/dt明顯降低，上調(diào)組大鼠LVEDP明顯降低，LVESP、+dp/dt、-dp/dt明顯升高(P<0.05)；與下調(diào)組相比，上調(diào)組大鼠LVEDP明顯降低，LVESP、+dp/dt、-dp/dt明顯升高(P<0.05)。見表2。

圖1 各組大鼠心肌病理組織學(xué)觀察(HE，×200)

表1 各組心功能比較

表2 各組血流動力學(xué)比較

2.4各組心肌細(xì)胞凋亡情況比較 與正常組〔(0.35±0.07)%〕相比，模型組、下調(diào)組、上調(diào)組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高〔(17.56±3.12)%、(20.12±5.24)%、(9.45±2.01)%，P<0.05〕；與模型組相比，下調(diào)組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高，上調(diào)組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；與下調(diào)組相比，上調(diào)組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組心肌細(xì)胞凋亡情況比較(TUNEL，×200)

2.5各組心肌細(xì)胞中Ca2+濃度、心肌組織中PLB、GRP78、CHOP-JNK-Caspase-12通路蛋白表達(dá)量比較 與正常組相比，模型組、下調(diào)組、上調(diào)組大鼠心肌細(xì)胞中Ca2+濃度、心肌組織中GRP78、CHOP、p-JNK、Caspase-12蛋白表達(dá)明顯升高，PLB蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，下調(diào)組大鼠心肌細(xì)胞中Ca2+濃度、心肌組織中GRP78、CHOP、p-JNK、Caspase-12蛋白表達(dá)明顯升高，PLB蛋白表達(dá)明顯降低，上調(diào)組大鼠心肌細(xì)胞中Ca2+濃度、心肌組織中GRP78、CHOP、p-JNK、Caspase-12蛋白表達(dá)明顯降低，PLB蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與下調(diào)組相比，上調(diào)組大鼠心肌細(xì)胞中Ca2+濃度、心肌組織中GRP78、CHOP、p-JNK、Caspase-12蛋白表達(dá)明顯降低，PLB蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。見表3，圖3。

表3 各組心肌細(xì)胞中Ca2+濃度、心肌組織中PLB、GRP78、CHOP-JNK-Caspase-12通路蛋白表達(dá)比較

圖3 Western印跡檢測各組心肌組織中PLB、GRP78、CHOP-p-JNK-Caspase-12通路

3 討 論

慢性心力衰竭發(fā)生的主要病理機(jī)制為肌漿網(wǎng)Ca2+調(diào)控障礙，因此通過對SERCA2a基因進(jìn)行傳導(dǎo)來對肌漿網(wǎng)Ca2+調(diào)控障礙改善目前已經(jīng)成為目前臨床上慢性心力衰竭基因治療靶點(diǎn)〔5,6〕。

心肌收縮過程中的Ca2+其主要來源為心肌肌漿網(wǎng)(SR)，SR上的鈣泵將存在于心肌細(xì)胞胞質(zhì)中的Ca2+重新攝回存儲，為下次心肌收縮提供鈣〔7〕。在正常機(jī)體狀態(tài)下SERCA2a主要存在于心肌、骨骼肌慢肌纖維中，當(dāng)胞質(zhì)中的Ca2+濃度顯著增加后會活SERCA2a，最終將細(xì)胞胞質(zhì)Ca2+攝入SR中〔8,9〕。當(dāng)慢性心力衰竭發(fā)生后會導(dǎo)致心肌組織中SERCA2a蛋白表達(dá)量降低，影響SERCA2a功能障礙，進(jìn)而影響SR攝取Ca2+障礙，導(dǎo)致心肌細(xì)胞胞質(zhì)中的Ca2+濃度降低，對心肌收縮期的Ca2+釋放產(chǎn)生影響，最終導(dǎo)致心肌收縮功能發(fā)生障礙〔10～12〕。本研究結(jié)果說明上調(diào)SERCA2a基因可在一定程度上提高心肌細(xì)胞中Ca2+濃度，改善慢性心力衰竭大鼠心肌收縮、舒張功能，最終改善大鼠心功能。

根據(jù)目前臨床上現(xiàn)有的研究〔13〕顯示，上調(diào)SERCA2a基因?qū)π募∷ソ叩淖饔猛緩捷^多，一方面通過上調(diào)SERCA2a基因可增加大鼠心肌組織中SERCA2a活性和表達(dá)，直接對慢性心力衰竭大鼠心肌收縮、舒張功能進(jìn)行改善；另一方面通過上調(diào)SERCA2a基因可改善心肌衰竭的能量代謝，進(jìn)而降低心肌細(xì)胞的耗氧量；此外，上調(diào)SERCA2a基因可減弱心肌細(xì)胞凋亡、重構(gòu)、肥厚等。目前研究認(rèn)為導(dǎo)致心功能不全和心肌衰竭較為重要的因素為心肌細(xì)胞凋亡〔14～16〕。心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有多種途徑，目前已被證實(shí)在缺血性心臟病和心力衰竭中的有著重要的作用〔17,18〕。心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑較多，在多種凋亡途徑中，主要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性途徑，包括CHOP-JNK-Caspase-12通路〔19〕。當(dāng)心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生后會誘導(dǎo)CHOP的高表達(dá)，屬于心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的特異性轉(zhuǎn)錄因子；Caspase家族中的成員較多，目前臨床上將其分為凋亡起始因子和執(zhí)行因子，其中Caspase-12在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中所產(chǎn)生，屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中所特有的因子，在內(nèi)凋亡途徑和外凋亡途徑中均不會被降解，屬于心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵因子，僅在心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡時被激活〔19,20〕。本研究結(jié)果提示，上調(diào)SERCA2a基因可能時通過抑制心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的CHOP-JNK-Caspase-12凋亡信號通路，起到改善大鼠心肌功能的作用。

綜上，上調(diào)SERCA2a可有效改善慢性心力衰竭大鼠心功能，其機(jī)制可能和抑制心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的心肌凋亡有關(guān)。