基于代謝組學分析腎虛督寒型強直性脊柱炎代謝網絡特點

梁偉東， 彭劍虹， 尹曉霞， 葉雪英， 陳少敬

（東莞市中醫院風濕科，廣東東莞 523200）

強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種以累及中軸關節為主，以骶骼關節和脊柱附著點炎癥為主要癥狀的疾病，表現為脊柱疼痛、僵直等不適，并逐漸出現脊柱畸形，最終可導致殘疾，使人失去生活自理能力，從而給家庭和社會帶來沉重的負擔[1-2]。AS的發病人群多以青少年男性為主，發病原因尚未明確，可能與人類白細胞表面抗原B27（HLA-B27）及遺傳相關，并受后天環境影響[3]。臨床發現，本病往往伴隨怕冷、四肢冰冷、夢中流涎等一系列腎虛表現，西醫難以解釋其伴隨癥狀的產生機制且對其處理效果欠佳。本病屬于祖國醫學“大僂”范疇，目前多數學者認為其病機為腎虛督寒，并且證實在此病機認識的基礎上采用中醫藥治療具有明顯優勢。但由于認識上存在一定的主觀性，以及辨證分型的不統一，從而影響了其在臨床的有效推廣應用。

代謝組學是一門對生物體內所有代謝物進行定量分析，研究生物體在不同狀態下機體內代謝物變化的學科，通過結合證候研究，以尋找該變化與證候特征的內在聯系，從而揭示機體生命活動的代謝本質[4]。基于此，本研究創新性收集腎虛督寒型AS患者證候樣本并結合現代技術進行代謝產物譜分析，從代謝網絡水平揭示AS與證候變化的內在聯系，為下一步研究和尋找中藥的作用靶點提供依據。

1 對象與方法

1.1研究對象收集2019年1月至2019年10月在東莞市中醫院門診或住院部接受治療的25例腎虛督寒型AS患者作為AS組；另外，收集同期來自東莞市中醫院體檢中心的健康受試者25例作為對照組（健康組）。本研究已通過東莞市中醫院倫理委員會的審查，并且所有受試者均簽署了知情同意書。

1.2病例選擇標準

1.2.1 診斷標準 西醫診斷標準：強直性脊柱炎的診斷參照1984年美國風濕病學會修訂的紐約標準。中醫辨證標準：參照國家中醫藥管理“十一五”重點專科協作組制定的《大僂（強直性脊柱炎）診療方案》中關于腎虛督寒型的中醫辨證標準。

1.2.2 納入標準 ①符合強直性脊柱炎的診斷標準；②符合腎虛督寒型的中醫辨證標準；③年齡介于16～60歲的患者。

1.2.3 排除標準 ①妊娠期或哺乳期婦女；②年齡小于16歲或大于60歲者；③合并有糖尿病、冠心病、腎功能不全等基礎疾病的患者；④同時患有其他風濕免疫性關節炎如白塞氏病、銀屑病性關節炎的患者；⑤合并有感染等急性并發癥的患者。

1.3試劑與儀器

1.3.1 試劑 無水磷酸二氫鈉（NaH2PO4）來自廣州廣試儀器有限公司，二水磷酸氫二鈉（Na2HPO4·2H2O）來自粵僑有限公司，重水（D2O）來自杭普實驗器材有限公司。

1.3.2 實驗儀器 超導核磁共振波譜儀（Varian NMR System 500MHz，美國瓦里安有限公司）；全自動生化分析儀BS-220（邁瑞，武漢盛世達醫療設備有限公司）；微孔板振蕩器（無錫杰瑞安儀器設備有限公司）；核磁管（寧杭普實驗器材有限公司）；TGL-20M臺式高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）。

1.4研究內容分析AS組與健康組血漿中代謝物差異，并配合分析2組受試者的中醫證候分布情況（主證包括腰痛、晨僵，次證包括惡寒怕冷、四肢不溫、夢中流涎、大便不調）及血沉（ESR）、C反應蛋白（CRP）、白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等各項炎癥指標的不同，以闡述腎虛督寒型AS的代謝特征和病理機制。

1.5研究方法

1.5.1 樣品預處理 分別抽取AS患者及健康受試者血樣6 mL，在4℃、頻率為10 000 Hz下離心10 min，吸取上層血清300μL至核磁管中，加入0.2 mol/L磷酸平衡液（pH=7.4）200μL和重水50μL，振蕩混勻。

1.5.2 核磁共振氫譜（1H-NMR）的測定分析 在25℃條件下，設置脈沖序列為Carr-Purcell-Mei boom-Gill，譜寬為10 000 Hz，回波時間為1 ms，進行64 k采樣點數，64次循環次數，128次疊加次數核磁掃描。核磁信號經過傅立葉變換轉為圖譜。

1.5.3 圖譜處理 使用專業軟件MestReNova（version 8.0.1）進行圖譜分析，把乳酸峰（δ1.33）作為化學位移參考峰，對所得圖譜進行相位、基線調整并自動積分，其區域規定為δ0.5～9.0，以0.005 ppm為積分間隔。消除δ4.7～5.1區域水峰（積分值設為零），將所得積分數據歸一化處理，以Excel形式保存，進行下一步多元化統計。

1.6數據處理和統計分析把上述積分數據導入SIMCA-P14.0軟件（Umetrics，瑞典）進行主成分分析（PCA）、偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）。作為評估模型驗證參數的R2和Q2，大于50%提示模型統計有效。OPLS-DA結果使用得分圖（score plot）和載荷圖（loading plot）的形式表示。通過分析得分圖中組間積分差異化學位移，在載荷圖找出對這種差異的貢獻值，并結合一維NMR譜圖峰值變化，尋找相對應的代謝產物。其他實驗數據使用SPSS 21.0統計軟件進行統計分析。計量資料用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料用率或構成比表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組受試者基線資料比較AS組25例受試者中，男14例（占56.0%），女11例（占44.0%）；平均年齡（31.64±4.23）歲。健康組25例受試者中，男14例（占56.0%），女11例（占44.0%）；平均年齡（30.91±3.87）歲。2組受試者的性別、年齡等基線資料比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

2.2 2組受試者證候分布情況比較表1結果顯示：AS組的腰痛、晨僵等主癥及惡寒怕冷、四肢不溫、夢中流涎、大便不調等次癥的分布頻率均明顯高于健康組，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 2組受試者的證候分布情況比較Table 1 Distribution of the syndrome manifestations in the two groups [例（%）]

2.3 2組受試者各項炎癥指標比較表2結果顯示：AS組的CRP、ESR、IL-6和TNF-α水平均明顯高于健康組，差異均有統計學意義（P＜0.05），提示AS患者處于炎癥活動期。

表2 2組受試者各項炎癥指標比較Table 2 Comparison of the levels of inflammatory indicators in the two groups （x±s）

2.4 2組受試者血漿中代謝物差異分析

2.4.1 2組受試者血漿中代謝物的1H-NMR分析 結果見圖1。通過觀察健康組和AS組血漿中代謝物的1H-NMR分析圖譜（化學位移區間δ0.5～9，放大8倍）的差異，并結合COSY、TOCSY、HSQC等數據庫[5-8]，對2組受試者存在差異的代謝物進行峰值歸屬，并查找其對應的代謝產物。結果發現，14種代謝產物可在肉眼下被區分，對于差異較少的代謝物，需要進行多元統計，以進一步挖掘存在差異的代謝產物。

圖1 強直性脊柱炎（AS）組和健康組血漿中代謝物的1H-NMR分析結果Figure 1 1H-NMR analysis results for the plasma metabolites in the AS group and healthy controlgroup

2.4.2 2組受試者血漿中代謝物的非監督PCA分析 對健康組與AS組的代謝物進行非監督PCA分析。由圖2可見，由于健康志愿者處于相對穩定代謝狀態，故分布相對集中，在組間差異中，2組基本能區分開，但仍有部分重疊（PC1vs.PC2，R2=88.8%，Q2=71.1%），提示模式良好。為取得更有意義統計結果，故進一步行PLS-DA和OPLSDA分析。

圖2 強直性脊柱炎（AS）組和健康組血漿中代謝物的PCA分析圖Figure 2 PCA analysis results for the plasma metabolites in the AS group and healthy controlgroup

2.4.3 2組受試者血漿中代謝物1H-NMR的PLSDA和OPLS-DA分析 進一步行PLS-DA分析，結果如圖3[R2x=80.6%，R2y=90.1%，Q2（cum）=82.7%]。由得分圖可以看出，2組的組間分布得到完全分開，但組內存在個別樣本分布相對分散。為尋找與發病機制及證型相關的代謝物，再次進行OPLS-DA分析，以提高模式識別方法的判定能力，得到結果如圖4-a[R2x=83.9%，R2y=91.9%，Q2（cum）=88.4%]。從圖中可以看出，組間無交叉和重疊，且2組各自集中分布，表明其模式是有效的。進一步行組間OPLS-DA結果的載荷圖分析（圖4-b），取權重系數（VIP）＞1，發現94個差異變量，結合實際圖譜，篩選出其中的19個代謝物，分別為HDL-C、異白氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脂類化合物、N-乙酰天冬酰胺、谷氨酸鹽、α-酮戊二酸、甘氨酸、馬尿酸鹽、酪氨酸、苯丙氨酸、甜菜堿、谷氨酰胺、脯氨酸、纈氨酸、膽 堿、精氨酸、蘇氨酸。

圖3 強直性脊柱炎（AS）組和健康組血漿中代謝物1H-NMR的PLS-DA分析圖Figure 3 PLS-DA graph of 1H-NMR analysis results for the plasma metabolites in the AS group and healthy controlgroup

圖4 強直性脊柱炎（AS）組和健康組血漿中代謝物1H-NMR的OPLS-DA分析得分圖（a）與載荷圖（b）Figure 4 OPLS-DA graph score plot（a）and loading plot（b）of 1H-NMR analysis results for the plasma metabolites in the AS group and healthy controlgroup

為了更直觀地表示代謝物變化趨勢及其貢獻，采用建立coefficient-loading相關圖的形式來表現代謝物的變化，運用back-scaling的數據處理模式，得到的圖譜為NMR圖譜的形狀[9]。結果見圖5和表3。由于把健康組作為參考組進行對比，故圖中向上的代謝峰說明AS患者的代謝物水平下降，而向下的代謝峰則說明AS患者的代謝物水平上升。從圖中的顏色分布可知，顏色越紅表示貢獻率越大，即相應的代謝物在2組之間的差異越顯著；顏色越藍表示貢獻率越小，即相應的代謝物在2組之間的差異越不顯著。由于本研究的研究人數為50例，查閱相關系界值數表，可以得出其相關系數臨界值︱r︱為0.556，表示如果代謝物的相關系數的絕對值大于0.556，即可說明該代謝物的變化具有顯著性差異。從表3結果可以看出，與健康組相比，AS組中的HDL-C、異白氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、N-乙酰天冬酰胺、脂類化合物、谷氨酸鹽、α-酮戊二酸、甘氨酸、肌醇、馬尿酸鹽及酪氨酸水平上升，而膽堿、丙氨酸、甜菜堿、谷氨酰胺、脯氨酸、纈氨酸、二甲胺、精氨酸、蘇氨酸的水平下降。

圖5 強直性脊柱炎（AS）組和健康組代謝產物差異對比圖Figure 5 Differences in the plasma metabolites in the AS group and healthy controlgroup

表3 2組受試者差異代謝產物的名稱及變化趨勢Table 3 The differentialmetabolites and their variation trend in the AS group and healthy controlgroup

2.5潛在代謝通路分析通過分析代謝物的變化能夠更好地體現人體代謝信息網絡，尋找異常代謝通路。把篩選出來的19種代謝輸入MetaboAnalyst 4.0進行分析，綜合HolmP值、FDR（false discovery rate）值和Impact值，共發現多條重要的代謝通路，其中前8條Pathway Impact＞0.1，被列為最主要的代謝途徑（圖6），它們分別為酪氨酸通路、甘氨酸-蘇氨酸代謝通路、苯丙氨酸通路、酮體通路、β-丙氨酸通路、丙酮酸通路、氨酰tRNA生物合成、乙醛酸和二元酸通路。根據實驗結果，結合KEGG數據庫，涉及到的代謝通路包括能量代謝、葡萄糖代謝、氨基酸代謝、脂類代謝以及胃腸道菌群及免疫紊亂，其從多方面影響脾-腎軸功能，從而形成腎虛督寒基本病機（圖7）。

圖6 強直性脊柱炎（AS）患者代謝網絡分析圖Figure 6 Metabolic network analysis for the AS patients

圖7 強直性脊柱炎（AS）患者腎虛督寒機制代謝通路分析圖Figure 7 Analysis of the pathway of the metabolites in the AS patients with the syndrome of deficiency of kidney and cold of governor vessel

3 討論

強直性脊柱炎（AS）屬于中醫學“大僂”“腰痛”等范疇，大多數醫家認為本病與腎有關。《脈要精微論》曰：“腰者腎之府，轉搖不能，腎將憊矣。”《醫學衷中參西錄》曰：“凡人之腰疼，皆脊梁處作疼，此實督脈主之……腎虛者，其督脈必虛，是以腰疼。”張錫純認為，脊髓袋，即尾閭關，其位于督脈，卻源自命門，連接任脈，任脈屬陰，督脈屬陽，是孕育精氣，封藏元氣的地方。由于本虛邪勝，元氣失于潛藏，督脈失養而生本病。全國名老中醫王慶國教授認為，本病以腎虛督脈失養為本，寒濕、熱瘀等為標，邪阻督脈，氣血虧虛，而發為本病[10]。我們從證候研究發現，AS患者多表現為腰背部或骶髂部疼痛，夜間明顯，以及晨僵等，逐漸累積至整條脊柱督脈所過之處，且伴隨怕冷、四肢不溫等腎虛表現，提示本病發生與先天不足、腎虛督寒有關。我們同時發現，患者出現夢中流涎、大便不調等脾虛濕阻表現，推測后天脾土參與疾病發生的全過程，因脾失運化，痰濕內生，土濕克腎水，阻礙經絡，從而加重腎虛督虧的情況。基于代謝組學，結合炎癥指標檢測結果，我們進一步研究發現，與健康體檢者相比，腎虛督寒型AS患者的代謝網絡存在異常，以下從不同的代謝途徑展開討論。

3.1能量代謝異常與AS的關系丙氨酸是參與葡萄糖代謝的重要產物，作為非必需氨基酸，在肝臟脫去氨基變成丙酮酸，后者再作為載體，經肝的糖異生再次生成葡萄糖，輸送到肌肉進行有氧代謝。我們發現AS患者丙氨酸水平升高，提示外周肌肉組織對葡萄糖利用障礙。而中醫學認為，脾主四肢，若脾陽虛衰，則四肢不溫。因此，本研究中大部分患者具有四肢不溫癥狀，我們推測這可能與外周肌肉對葡萄糖的利用減少有關。

葡萄糖進行有氧代謝，生成丙酮酸，隨后進入三羧酸循環。后者經異構并氧化脫羧生成α-酮戊二酸，再氧化脫氨生產谷氨酸，在此過程中為機體提供能量，維持正常生命活動活力。我們發現AS患者α酮戊二酸及谷氨酸水平升高，提示代謝途徑受阻，存在能量代謝異常。同時我們發現AS患者多表現為腰痛，夜間尤甚，以及惡寒怕冷、四肢不溫等一派虛寒之象，謝國倩等[11]認為與患者腎-脾軸功能減退相關。由于有氧代謝均在線粒體發生，因此我們推測患者腎-脾軸功能可能與線粒體功能異常相關。

3.2脂質代謝通路與AS的關系膽堿是組成卵磷脂的主要成分，在肝臟與腎臟中進一步生產甜菜堿，后者內含三個活性甲基，具有高度化學活性，可分解為三甲胺，提供甲基以合成甘氨酸。甜菜堿及甘氨酸均具有調節炎癥反應作用，抑制炎癥細胞因子的轉錄，使炎癥因子及氧自由基合成下降，同時改善脂類代謝，降低機體炎癥反應[12-13]。N-乙酰天冬酰胺與膽堿結合，生成磷脂酰膽堿。CUPPEN B V J等[14]研究發現，磷脂酰膽堿與CRP結合以啟動宿主免疫反應，而脂肪酸具有促進炎癥效果，能與IL-6、TNF-α等抗炎分子的前體相結合，釋放炎癥介質。He Z X等[15]通過檢測AS患者糞便代謝物發現類固醇化合物存在性別差異，但AS發病率是否與性別相關，目前尚未見相關報道。

本研究發現AS患者的膽堿、甜菜堿、三甲胺水平下降，甘氨酸及脂類化合物水平上升，提示患者甜菜堿-甘氨酸代謝通路、膽堿、脂質代謝通路異常，而且CRP、ESR、IL-6及TNF-α等炎癥指標明顯升高，因此我們推測上述通路參與炎癥反應激活途徑。

3.3氨基酸代謝通路與AS的關系本研究發現AS患者的氨基酸水平發生異常。支鏈氨基酸包括纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸等，經脫氨基生成糖類、酮類，后者形成乙酰輔酶A，進入三羧酸循環。AS患者的上述3種氨基酸含量上升說明氨基酸代謝發生異常改變，使得氨基酸不能正常地進入三羧酸循環，糖酵解增強，從而增加氧化應激及細胞受損[16]。

人體中有多種神經-內分泌調節活性物質如腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺等，酪氨酸是這些物質合成的基礎[17]。它是由苯丙氨酸羥基化生成，為神經遞質合成前體。本研究發現AS患者的酪氨酸水平上升，提示酪氨酸代謝通路受阻，我們推測其可能對神經-內分泌調節產生影響，從而造成患者怕冷、夢中流涎等腎虛表現，這有助于進一步解釋AS患者腎虛督寒的形成機制。

3.4免疫功能紊亂與AS的關系蘇氨酸具有促進磷脂合成及使脂肪酸進一步氧化，作為免疫球蛋白的主要合成原料，參與人體免疫反應，其缺乏時，影響免疫代謝，降低人體抵抗病毒與體內細胞異常增殖的能力下降[18]。本研究發現患者的蘇氨酸水平下降，提示AS患者存在免疫異常。

脯氨酸、精氨酸均參與人體細胞凋亡。郭棚[19]研究發現，在體外培植時，增加精氨酸可使母豬滋養層細胞增殖增加，細胞凋亡受抑制。而脯氨酸能加速牙釉質修復，在代謝中，生產羥脯氨酸和羥賴氨酸，后者是合成膠原蛋白，促進軟骨愈合的原料。AS患者大多表現為骶髂關節軟骨破壞，骨質增生融合，同時合并外周關節附著點炎癥，這些表現均與軟骨及膠原蛋白異常有關。中醫認為，腎主骨，藏精而生髓。病理情況下，督虛元氣失藏，不能生髓，“髓”功能異常，臨床表現為腰痛、晨僵、脊柱活動指數下降。本研究發現，AS患者的脯氨酸、精氨酸代謝下降，引起免疫功能紊亂，細胞凋亡加快，軟骨修復減慢，從而導致骶髂關節炎癥，是“腎主髓”功能下降的表現形式之一。

3.5腸道功能紊亂與AS的關系在人體腸道絨毛上部成熟線粒體中，存在谷氨酸-谷氨酰胺循環，谷氨酸與谷氨酰胺互相轉換，生產大量三磷酸腺苷（ATP），為腸內營養代謝提供能量，能有效改善膿毒癥患者腸黏膜屏障功能[20-21]。本研究發現AS患者谷氨酰胺水平下降，谷氨酸鹽水平上升，比例失調，提示谷氨酸-谷氨酰胺循環障礙，腸道能量利用受阻。中醫的脾主運化，應涵蓋了現代醫學胃腸道功能范疇。脾土久虛（腸道能量不足），氣血生化無源，可進一步導致腎虛失養而引發本病，故我們推測谷氨酸-谷氨酰胺循環障礙可能是其發病機制之一。

腸道微生物將飲食中的芳香族化合物分解成苯酸鹽，后者在肝腎中與甘氨酸結合，形成馬尿酸鹽，是腸道菌群代謝產物，參與腸道炎癥反應。臨床研究[22-23]發現，AS患者往往伴發腹瀉、腹痛等炎癥腸病。我們的證候研究結果也提示大部分AS患者伴隨大便不調情況，可能與腸道菌群代謝失調相關。脾虛生濕，濕濁內陷，濕土克于腎水，影響脾-腎功能軸而發為本病。因此，我們推測脾虛生“濕”，可能與胃腸道菌群失調有關，需要后續進一步研究。

綜上所述，本研究使用1H-NMR技術的代謝組學方法，探討了腎虛督寒型AS患者血中代謝產物的變化趨勢，初步篩選出亮氨酸、異亮氨酸、脂類化合物、谷氨酸鹽、α-酮戊二酸、甘氨酸、馬尿酸鹽、酪氨酸、苯丙氨酸、甜菜堿、谷氨酰胺、脯氨酸、纈氨酸、膽堿、三甲胺、精氨酸、蘇氨酸等物質作為本病的早期診斷的潛在生物標志物，涉及8條代謝通路。提示腎虛督寒型AS的發病機制可能與患者的能量代謝、氨基酸代謝、脂類代謝以及胃腸道菌群和免疫紊亂等代謝異常有關，從而從多方面影響脾-腎功能軸而形成腎虛督寒病機。但由于我們僅分析血清中的代謝，具有一定局限性，仍需要后期完善免疫復合物檢測及病理，來驗證本研究結論。