冰片衍生物對血腦屏障通透性影響的研究

陳傳兵， 劉昌輝， 伍海濤， 張榮， 趙威， 李偉榮， 楊蕾， 宓穗卿， 王寧生

（廣州中醫藥大學，廣東廣州 510405）

血腦屏障是多樣而復雜的動態系統，它允許血液循環中腦組織所需的營養物質通過，有效地阻擋有害物質的侵入，又能將代謝產物排出，并根據腦內成分的各種需要作出反應，從而維持腦環境的恒定，保證中樞神經系統的正常結構和功能。但血腦屏障同時也阻礙了藥物進入大腦，導致藥物難以透過血腦屏障達到腦內有效治療濃度，從而給腦部疾病如腦腫瘤、中樞神經系統感染、藥物成癮性等疾病的治療造成困難。冰片是一種常用中藥，具有廣泛的藥理作用，如：鎮痛抗炎[1]、抗菌[2]、抗血栓[3]等，最突出的是促進藥物透過血腦屏障的作用[4-5]。在長期的臨床用藥中，冰片自身存在的弱點逐漸顯露出來，如藥效作用不強、刺激性大、揮發性強[6]，并存在一定毒副作用等[7]特點，這些成為了影響冰片臨床應用的主要因素。為了降低冰片毒副作用，增強藥效，課題組前期對冰片進行結構修飾，合成了多個未見文獻報道的冰片衍生物[8-9]，并研究了冰片衍生物的鎮痛作用[10]和對驚厥模型小鼠氨基酸類神經遞質的影響[11]。本研究通過比較10種冰片衍生物與冰片在小鼠體內透血腦屏障效果，篩選藥效作用較強、不易揮發，毒副作用較低的冰片衍生物，為開發新一代透血腦屏障藥物提供實驗依據，這對于拓展冰片的應用范圍，對腦靶向給藥系統的研究和腦部疾病的治療具有較大的參考價值。現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1動物清潔級昆明種小鼠，雌雄各半，體質量（18±5）g，由廣東省衛生廳實驗動物中心提供，動物質量合格證號：SCKK粵2008-0002。適應性喂養3 d（溫度20～25℃，濕度60%～70%）后，用于實驗。給藥前小鼠禁食過夜，自由飲水。

1.2藥物與試劑2-氯苯甲酸冰片酯、3，5-二硝基苯甲酸冰片酯、3-硝基苯甲酸冰片酯、4-硝基苯甲酸冰片酯、1-萘乙酸冰片酯、對氯苯甲酸冰片酯、苯甲酸冰片酯、3-甲基苯甲酸冰片酯、4-甲基苯甲酸冰片酯、三氯乙酸冰片酯（冰片衍生物均為本課題組自制，純度大于98%）；5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），吐溫-80，右旋冰片（含量97.5%，江西吉安林科天然冰片廠生產，使用前研粉，過100目篩備用）。醫用酒精，生理鹽水、丙酮、伊文思藍（購自廣州東巨化學試劑公司，均為分析純）。

1.3儀器AUM2200電子分析天平（日本Shimadzu公司）；KDC-220HR高速冷凍離心機（科大創新股份有限公司中佳分公司）；EnSpire多功能酶標儀（美國Perkin Elmer公司）。

1.4藥液配制精密稱取0.4 g伊文思藍轉移入100 mL容量瓶中，加生理鹽水定容至刻度線即得0.4%溶液（w/v）；丙酮和生理鹽水混勻（7∶3）（v∶v）即得用于勻漿的混合液。各精密稱取2-氯苯甲酸冰片酯、3，5-二硝基苯甲酸冰片酯、3-硝基苯甲酸冰片酯、4-硝基苯甲酸冰片酯、1-萘乙酸冰片酯、4-氯苯甲酸冰片酯0.5 g，研磨后各加5%CMC-Na助溶配成懸浮液（50 mg/mL）；各精密稱取0.5 g苯甲酸冰片酯、3-甲基苯甲酸冰片酯、4-甲基苯甲酸冰片酯、三氯乙酸冰片酯，研磨后加5%吐溫-80助溶配成溶液（50 mg/mL）；精密稱取0.5 g右旋冰片2份，一份研磨后加10 mL 5%CMC-Na助溶配成濃度為50 mg/mL的懸浮液，另一份研磨后加入10 mL 5%吐溫-80助溶配成濃度為50 mg/mL的溶液。

1.5伊文思藍標準曲線繪制用空白小鼠腦漿配制伊文思藍倍釋系列濃度溶液0、1、2、5、10、20、50μg/g，用酶標儀于630 nm波長處檢測光密度，求得標準曲線。

1.6分組與給藥方法根據藥物的溶解性，采用2種溶劑作對照，即CMC-Na組和吐溫-80組。其中：CMC-Na組包括5%CMC-Na溶劑組、右旋冰片（陽性對照）組、2-氯苯甲酸冰片酯組、4-氯苯甲甲酸冰片酯組、3-硝基苯甲酸冰片酯組、4-硝基苯甲酸冰片酯組、3，5-二硝基苯甲酸冰片酯、1-萘乙酸冰片酯組，每組16只，雌雄各半；吐溫-80組包括吐溫-80溶劑組、右旋冰片組（陽性對照）、苯甲酸冰片酯組、3-甲基苯甲酸冰片酯組、4-甲基苯甲酸冰片酯組、三氯乙酸冰片酯組，每組16只，雌雄各半。

1.7透血腦屏障作用實驗小鼠按體質量（0.02 mL/g）灌服給藥60 min后，于尾靜脈注射0.4%伊文思藍溶液（10 mL/kg），2 min后斷頭取腦，腦組織用生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱質量，按1∶8（w∶v）加入丙酮-生理鹽水（7∶3）（v∶v）勻漿，勻漿液于70℃孵育0.5 h，以3 000 r/min離心15 min，取200μL上清液，用酶標儀于630 nm波長處檢測其光密度。

1.8統計方法采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析，計量資料結果以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩比較用LSD檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1伊文思藍的標準曲線見圖1。酶標儀法：y=0.010 5x+0.050 3，R2=0.999 6。結果表明線性關系良好，符合生物樣品測定要求。

2.2酶標儀法測定冰片衍生物開放血腦屏障作用實驗結果用CMC-Na作助溶劑的冰片衍生物中，2-氯苯甲酸冰片酯組血腦屏障通透性效果顯著優于右旋冰片組（陽性對照），差異有統計學意義（P<0.001）；4-硝基苯甲酸冰片酯和1-萘乙酸冰片酯組效果與右旋冰片組相當，差異無統計學意義（P>0.05）；而4-硝基苯甲酸冰片酯組、3，5-二硝基苯甲酸冰片酯組、1-萘乙酸冰片酯的效果顯著低于右旋冰片組。具體結果見表1。

圖1 伊文思藍標準曲線（酶標儀法）Figure 1 Evens blue standard curve（enzyme-labeled instrument method）

表1 用CMC-Na作助溶劑的冰片衍生物對小鼠血腦屏障通透性的影響Table 1 Effect of borneolderivatives dissolved in CMC-Na on blood-brain-barrier permeability in mice （x±s）

用吐溫-80作助溶劑的冰片衍生物中，各藥物組與右旋冰片組（陽性對照）相比，效果相當，無顯著性差異（P>0.05），具體結果見表2。

表2 用吐溫-80作助溶劑的冰片衍生物對小鼠血腦屏障通透性的影響Table 2 Effect of borneolderivatives dissolved in Tween-80 on blood-brain-barrier permeability in mice （x±s）

3 討論

本實驗結果表明：在10種冰片衍生物中，只有2-氯苯甲酸冰片酯的血腦屏障通透性優于右旋冰片；苯甲酸冰片酯、3-甲基苯甲酸冰片酯、4-甲基苯甲酸冰片酯、三氯乙酸冰片酯、4-硝基苯甲酸冰片酯和萘乙酸冰片酯效果與右旋冰片相當；3-硝基苯甲酸冰片酯、3，5-二硝基苯甲酸冰片酯和4-氯苯甲酸冰片酯效果低于右旋冰片。2-氯苯甲酸冰片酯的血腦屏障通透性顯著優于右旋冰片，因此，其有望開發成為新一代透血腦屏障的藥物。