加味人參四逆湯對(duì)急性心肌梗死后心力衰竭大鼠心功能的保護(hù)機(jī)制研究

李影雄， 蔡海榮， 蔡惠鈴， 蔡鑫桂， 李志雄， 李懷國(guó)， 雷凱君

（1.佛山市中醫(yī)院，廣東佛山 528000；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東廣州 510120）

急性心肌梗死是指冠狀動(dòng)脈閉塞血流中斷引起的心臟缺血缺氧性壞死，具有高發(fā)病率、高致殘率、高致死率等特點(diǎn)。心力衰竭是急性心肌梗死的嚴(yán)重并發(fā)癥，心肌梗死-心室重構(gòu)-心力衰竭這一心血管事件鏈?zhǔn)菍?dǎo)致急性心肌梗死患者死亡的最主要原因[1]。急性心肌梗死后心臟發(fā)生心室重構(gòu)，引起心室收縮功能異常，最后發(fā)展為心力衰竭，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和預(yù)后。調(diào)查顯示，全球約40%急性心肌梗死患者出現(xiàn)心力衰竭[2]，而心肌梗死后一旦出現(xiàn)心力衰竭，5年生存率僅為35%[3]，合并重度心力衰竭的急性心肌梗死患者1年死亡率更是高達(dá)50%[4]。因此，防治心肌梗死后心力衰竭對(duì)降低急性心肌梗死患者的病死率和改善預(yù)后均具有重要的意義。心肌梗死后心力衰竭屬于中醫(yī)學(xué)“喘證”“心悸”“水腫”等范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，本病病機(jī)總屬于陽(yáng)虛水泛，陽(yáng)虛不能化水，水凌心肺，發(fā)為喘證，故治療當(dāng)以溫陽(yáng)制水為大法。加味人參四逆湯是在人參四逆湯基礎(chǔ)上加川芎、葶藶子、茯苓而成，具有益氣溫陽(yáng)、活血利水作用。本課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，加味人參四逆湯用于治療急性心肌梗死后心力衰竭患者，可以降低患者血清腦利鈉肽（BNP）、肌鈣蛋白T（cTnT）、肌酸激酶同工酶含量，提高左心室射血分?jǐn)?shù)，減輕水腫。為進(jìn)一步探討加味人參四逆湯治療急性心肌梗死后心力衰竭的作用機(jī)制，本研究觀察加味人參四逆湯對(duì)急性心肌梗死后心力衰竭大鼠心功能、血流動(dòng)力學(xué)、神經(jīng)體液因子、心肌纖維化的影響，以期為其臨床治療急性心肌梗死后心力衰竭提供依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物SPF級(jí)健康雄性SD大鼠55只，6～7周齡，體質(zhì)量（180±20）g，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2019-0035。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～25℃，濕度50%～65%，光照/黑暗12 h交替。實(shí)驗(yàn)單位：廣東省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2018-0094]。

1.2藥物加味人參四逆湯（紅參10 g，熟附子15 g，干姜10 g，甘草6 g，葶藶子10 g，川芎10 g，茯苓10 g）中藥由國(guó)藥集團(tuán)馮了性（佛山）藥材飲片有限公司提供，由佛山市中醫(yī)院制劑中心制備，每次加入5倍量的水煎煮2次，每次煎煮50 min，合并煎液，過(guò)濾，濃縮至1 g/mL，于-4℃冰箱保存下備用。培哚普利叔丁胺片，施維雅（天津）制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20034053，批號(hào)：20190312。

1.3試劑與儀器大鼠BNP酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，貨號(hào)：CSB-E07972r-1）；大鼠cTnT ELISA試劑盒（上海莼試生物科技有限公司，貨號(hào)：CSELISA5303）；大鼠血管緊張素I（Ang I）ELISA試劑盒（上海澤葉生物科技有限公司，貨號(hào)：H-ELANG I），大鼠醛固酮（ALD）ELISA試劑盒（上海古朵生物科技有限公司，貨號(hào)：GD-AW2091）；大鼠心房鈉尿肽（ANP）ELISA試劑盒（武漢菲恩生物科技有限公司，貨號(hào)：ER0738）；丙二醛（MDA）ELISA試劑盒（上海研生實(shí)業(yè)有限公司，貨號(hào)：YS-E8429）；超氧化物歧化酶（SOD）ELISA試劑盒（武漢菲恩生物科技有限公司，貨號(hào)：ER0332）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒（上海研生實(shí)業(yè)有限公司，貨號(hào)：YS-E8689）；白細(xì)胞介素1（IL-1）ELISA試劑盒（上海研生實(shí)業(yè)有限公司，貨號(hào)：YS-E8809）。KH20R-Ⅱ多功能冷凍離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）；SpectraMax iD5酶標(biāo)儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]；SpectraMax QuickDrop超微量全波長(zhǎng)分光光度計(jì)[美谷分子儀器（上海）有限公司]；MP2001電子天平（南京菲奇工貿(mào)有限公司）；倒置熒光顯微鏡[徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易公司]。

1.4動(dòng)物分組與模型構(gòu)建將55只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、培哚普利組和中藥組，每組15只。將模型組、培哚普利組和中藥組大鼠采用手術(shù)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支（LAD）方法建立急性心肌梗死后心力衰竭模型。方法：將大鼠腹腔注射40 mg/kg苯巴比妥麻醉后，氣管插管輔助通氣，仰臥位固定，頸、胸部備皮消毒，打開(kāi)胸廓后撕開(kāi)心包膜暴露心臟，尋找冠狀動(dòng)脈左前降支并在中上1/3處結(jié)扎，觀察心臟由粉紅色變?yōu)榘瞪n白色后回納至胸腔，縫合胸壁，術(shù)后注射青霉素200萬(wàn)U·kg-1·d-1預(yù)防感染。假手術(shù)組大鼠僅開(kāi)胸后穿刺，不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支。術(shù)后14 d應(yīng)用心臟彩超檢測(cè)左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF），若LVEF下降20%～30%即可判斷急性心肌梗死后心力衰竭大鼠模型建立成功。結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中假手術(shù)組大鼠死亡1只，模型組和中藥組各死亡6只，培哚普利組死亡7只，模型組1只造模不成功，予以剔除，各組剩余大鼠造模均成功。

1.5給藥方法按照徐叔云等[5]主編的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率關(guān)系換算，中藥組大鼠組給予加味人參四逆湯7.5 g·kg-1·d-1進(jìn)行灌胃，每天2次；培哚普利組大鼠給予培哚普利叔丁胺片混懸液0.42 mg·kg-1·d-1灌胃，每天2次；假手術(shù)組和模型組大鼠給予等體積的生理鹽水灌胃，每天2次。連續(xù)給藥14 d。

1.6血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)采集最后1次灌胃后禁食不禁飲12 h后，給予大鼠腹腔注射100 g/L水合氯醛麻醉后，頸部常規(guī)消毒后，分離皮膚、肌肉組織后尋找頸總動(dòng)脈，用手術(shù)剪剪開(kāi)頸總動(dòng)脈，插入左心室導(dǎo)管，將導(dǎo)管的另一端連接八導(dǎo)生理記錄儀，記錄大鼠心臟頻率（HR）、左心室內(nèi)壓最大上升速率（+dp/dtmax）、左心室內(nèi)壓最大下降速率（-dp/dtmax）、左心室內(nèi)壓（LVSP）、左心室舒張末期壓（LVEDP）。應(yīng)用心臟彩超檢測(cè)LVEF。

1.7實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)采集血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)后，開(kāi)腹，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血10 mL，以3 000 r/min離心15 min，取血清，-80℃保存，檢測(cè)血清BNP、cTnT、Ang I、ALD、ANP的含量。稱取心臟組織500 mg，加生理鹽水4℃研磨制成10%勻漿，以3 000 r/min離心15 min，取上清液，采用ELISA法檢測(cè)心肌組織MDA、SOD、TNF-α、IL-1水平。

1.8病理學(xué)檢測(cè)將大鼠麻醉后開(kāi)胸暴露心臟，取心臟梗死組織，以多聚甲醛固定24 h，脫水包埋，制成5μm切片。蘇木素-伊紅（HE）染色后，顯微鏡下觀察心肌組織形態(tài)和纖維化程度。

1.9統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one way ANOVA）方法，兩兩間比較采用LSD-t方法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的比較表1結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠HR、+dp/dtmax、LVSP、LVEF水平明顯降低（P＜0.05），-dp/dtmax、LVEDP水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和培哚普利組大鼠HR、+dp/dtmax、LVSP、LVEF水平明顯升高（P＜0.05），-dp/dtmax、LVEDP水平明顯降低（P＜0.05），且2個(gè)治療組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表1 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的比較Table 1 Comparison of the hemodynamic indexes between various groups of rats （x±s）

2.2各組大鼠血清BNP、cTnT、Ang I、ALD、ANP水平的比較表2結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清BNP、cTnT、Ang I、ALD、ANP水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和培哚普利組大鼠血清BNP、cTnT、Ang I、ALD、ANP水平均明顯降低（P＜0.05），且2個(gè)治療組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表2 各組大鼠血清BNP、cTnT、Ang I、ALD、ANP水平的比較Table 2 Comparison of the serum BNP，cTnT，Ang I，ALD，ANP levels between various groups of rats （x±s）

2.3各組大鼠心肌MDA、SOD、TNF-α、IL-1水平的比較表3結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌SOD水平明顯降低（P＜0.05），MDA、TNF-α、IL-1水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和培哚普利組大鼠心肌SOD水平明顯升高（P＜0.05），MDA、TNF-α、IL-1水平明顯降低（P＜0.05），且2個(gè)治療組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表3 各組大鼠心肌MDA、SOD、TNF-α、IL-1水平的比較Table 3 Comparison of the levels of MDA，SOD，TNF-α，IL-1 in cardiac muscle tissue between various groups of rats （x±s）

2.4各組大鼠心肌結(jié)構(gòu)變化圖1結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠心肌組織染色均勻，心肌纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，分界清晰，排列規(guī)則，間質(zhì)未見(jiàn)明顯異常，未見(jiàn)明顯炎癥；模型組大鼠心肌組織局部大量心肌細(xì)胞消失，被增生的纖維結(jié)締組織取代，可見(jiàn)較多新生毛細(xì)血管，并伴有炎性細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)；中藥組和培哚普利組大鼠正常心肌細(xì)胞較模型組大鼠增多，纖維結(jié)締組織較模型組減少，炎性細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組大鼠減輕。

圖1 各組大鼠心肌結(jié)構(gòu)變化比較（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of the changes of myocardial structure between various groups of rats（by HE staining，×200）

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，急性心肌梗死后心力衰竭為本虛標(biāo)實(shí)之病，以陽(yáng)氣虛為本，瘀、水為標(biāo)。腎為水臟，心主血脈，急性心肌梗死后陽(yáng)氣虧虛，腎虛則不能蒸化水液，心虛則血脈無(wú)主，水濕凝聚，氣為血之帥，氣虛則血行不暢而為瘀血，陽(yáng)虛則血寒凝固而為瘀血，血不利則為水，兩水相合，上凌心肺，發(fā)為心悸、氣短、咳喘、口唇紫紺、腹脹、水腫之癥[6-7]。因此，治療急性心肌梗死后心力衰竭應(yīng)以溫陽(yáng)益氣、活血利水為法。人參四逆湯（《傷寒論》），由人參、附子、干姜、甘草組成，方中：人參為補(bǔ)氣要藥，大補(bǔ)元?dú)猓堂撋颍桓阶訛轵?qū)寒回陽(yáng)要藥，辛甘大熱，走而不守，回陽(yáng)救逆，補(bǔ)火助陽(yáng)，兼暖脾土，化氣制水；干姜溫中補(bǔ)陽(yáng)，助附子溫陽(yáng)化氣以行水，又暖脾土以制水；甘草益氣溫中，又緩和附子、干姜之燥烈。本方在人參四逆湯基礎(chǔ)上，加川芎以活血化瘀，加葶藶子宣肺平喘、利水消腫，加茯苓健脾益氣、利水滲濕。諸藥合用，共奏溫陽(yáng)益氣、活血利水之功。現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果顯示，附子中去甲烏藥堿具有增強(qiáng)心肌收縮力、加快心率、抗休克、保護(hù)心肌等作用[8]，人參皂苷具有增強(qiáng)心肌收縮力、提高心輸出量、保護(hù)心肌、抗休克等作用[9]。在前期臨床研究獲得肯定療效的基礎(chǔ)上，從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)角度進(jìn)一步探討該方的作用機(jī)制具有重要意義。

急性心肌梗死后心力衰竭的發(fā)生可能與心肌纖維化導(dǎo)致的心室重構(gòu)、心肌細(xì)胞炎性浸潤(rùn)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、神經(jīng)體液因子等密切相關(guān)，是多種因素綜合作用的結(jié)果。心室重構(gòu)是急性心肌梗死后大鼠最主要的病理變化，也是導(dǎo)致心力衰竭的重要原因[10]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌梗死后出現(xiàn)明顯的心肌炎性浸潤(rùn)和心肌纖維化，經(jīng)過(guò)加味人參四逆湯干預(yù)后心肌炎性浸潤(rùn)和心肌纖維化明顯減輕。提示加味人參四逆湯可以改善急性心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌炎性浸潤(rùn)和減輕心肌纖維化。

BNP是一種心臟神經(jīng)激素，主要由心室分泌，當(dāng)急性心肌梗死患者發(fā)生心力衰竭時(shí)，心室壁張力增加導(dǎo)致BNP合成增加并釋放至血清中。BNP可反映左功能變化，并且是評(píng)價(jià)心力衰竭嚴(yán)重程度和預(yù)測(cè)病死率的重要指標(biāo)[11]。cTnT是急性心肌梗死時(shí)心肌損傷的特異性和敏感性指標(biāo)，正常血清中cTnT含量極低，當(dāng)心肌損傷時(shí)血清中cTnT水平顯著升高。因此，測(cè)定血清BNP、cTnT含量可評(píng)價(jià)心力衰竭的發(fā)生和嚴(yán)重程度。心力衰竭發(fā)生時(shí)心臟功能明顯減弱，而心臟功能亦可以通過(guò)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。另外，LVSP是等容收縮期左心室內(nèi)壓力峰值，當(dāng)心肌收縮力增強(qiáng)時(shí)LVSP可升高，是評(píng)價(jià)左室收縮功能的重要指標(biāo)[12]；LVEDP為左心室舒張末期內(nèi)壓，反映左心室舒張功能和順應(yīng)性，而心力衰竭患者由于收縮能力減弱而引起左心室舒張末期容量增加，進(jìn)而引起LVEDP也升高；+dp/dtmax反映心肌收縮成分的縮短最大速度，可評(píng)價(jià)左心室收縮功能；而-dp/dtmin反映了心肌舒張時(shí)心肌纖維舒張最大速度，可評(píng)價(jià)左室舒張功能；+dp/dtmax與-dp/dtmin一起可綜合反映左心室的收縮和舒張功能；LVEF可評(píng)價(jià)左心室射血能力，心力衰竭患者由于左心室收縮功能降低而引起射血能力減弱。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠HR、+dp/dtmax、LVSP、LVEF水平明顯降低（P<0.05），-dp/dtmax、LVEDP和血清BNP、cTnT水平明顯升高（P<0.05）；而經(jīng)過(guò)加味人參四逆湯干預(yù)后，HR、+dp/dtmax、LVSP、LVEF水平明顯升高（P<0.05），-dp/dtmax、LVEDP和血清BNP、cTnT水平明顯降低（P<0.05）。提示加味人參四逆湯可以改善急性心肌梗死后心力衰竭大鼠的心功能，提高射血分?jǐn)?shù)。

心力衰竭的發(fā)生與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活密切相關(guān)。腎素活性升高，使AngⅠ水平明顯提高，并且在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶作用下轉(zhuǎn)化為AngⅡ，后者進(jìn)一步刺激腎上腺皮質(zhì)分泌ALD，引起水鈉潴留，增加心室容量負(fù)荷和房室壓力[13]。心力衰竭時(shí)心室分泌ANP，在一定程度上可減輕心臟負(fù)荷，緩解心力衰竭引起的血容量增加，改善心功能，但是其作用微弱[14]。隨著心力衰竭發(fā)展和惡化，血清中ANP含量明顯增加，因而ANP是評(píng)價(jià)心力衰竭的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清AngⅠ、ALD、ANP水平明顯升高（P<0.05），而經(jīng)過(guò)加味人參四逆湯干預(yù)后大鼠血清AngⅠ、ALD、ANP水平明顯降低（P<0.05）。提示加味人參四逆湯可以抑制急性心肌梗死后心力衰竭大鼠神經(jīng)體液因子的分泌。

心力衰竭的發(fā)生發(fā)展還與氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)密切相關(guān)。急性心肌梗死后心肌組織自由基生成增加，破壞心肌細(xì)胞膜，發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化[15]。正常情況下，體內(nèi)存在清除自由基和抑制自由基反應(yīng)的酶系統(tǒng)，如SOD可以清除氧自由基，維持動(dòng)態(tài)平衡。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，可以反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。急性心肌梗死時(shí)心肌產(chǎn)生大量炎性因子，TNF-α和IL-1分泌明顯上升，不僅可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和心室重塑，惡化心力衰竭的發(fā)展，而且可以引起炎癥瀑布級(jí)聯(lián)反應(yīng)[16-17]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌SOD水平明顯降低，MDA、TNF-α、IL-1水平明顯升高（均P<0.05），而經(jīng)過(guò)加味人參四逆湯干預(yù)后，SOD水平明顯升高，MDA、TNF-α、IL-1水平明顯降低（均P<0.05）。提示加味人參四逆湯可減輕急性心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)。

綜上所述，加味人參四逆湯可以改善急性心肌梗死后心力衰竭大鼠的心功能，改善血流動(dòng)力學(xué)，抑制神經(jīng)體液因子分泌，減輕心肌氧化應(yīng)激、炎性浸潤(rùn)和纖維化。