藍刺頭對PMOP大鼠體質量時序性變化、子宮組織形態的影響

劉 晉，趙 軍

(1.內蒙古自治區中醫醫院，內蒙古 呼和浩特 010020；2.內蒙古醫科大學附屬醫院，內蒙古 呼和浩特 010110)

絕經后骨質疏松癥(Postmenopausal osteoporosis，PMOP)屬高轉換型的原發性骨質疏松癥，是一種由于絕經后婦女卵巢功能衰退、雌激素水平下降，繼發甲狀旁腺功能亢進、降鈣素分泌不足，從而導致骨吸收大于骨形成，骨量逐漸減少，以單位體積骨量減少和骨組織微結構退變、破壞為特征，最終導致骨骼脆性增加而易于發生骨折的全身代謝障礙性骨病[1]。流行病學資料顯示中國大于60歲人群中的女性原發性骨質疏松癥發病率為28.6%，并趨向于逐年升高[2]，因此，尋求有效預防和治療PMOP的方法有重要現實價值。目前，現代醫學用于治療PMOP的藥物較多，但各類藥物的有效性與安全性均存在爭議，如長期使用雌激素類藥物有導致乳腺癌、子宮內膜癌及發生血栓的潛在危險，其風險甚至超過受益；而長期補鈣易增加心血管事件風險[3]。所以在傳統民族醫藥中尋求療效可靠、毒副作用小的防治方法具有重要意義。但在眾多有關傳統民族醫藥防治骨質疏松癥的動物實驗中，研究方向多為從骨代謝細胞因子、免疫組化學，甚至受體基因調控機制等角度探討其作用機理，而有關藥物對體質量的影響，以及對子宮的安全性，尤其是和目前臨床常應用的雌激素替代療法相比較，其研究報道相對較少。

本研究所用的民族藥藍刺頭(蒙醫名“烏日格斯圖呼和”)，菊科藍刺頭屬，漏蘆的干燥頭狀花序，載于蒙醫醫典《智慧文鑒》，有固骨質、接骨愈傷之功效，用于治療筋傷骨折、金創、刺痛等癥[4]。

前期課題已對藍刺頭有效成分進行了提取，證明了藍刺頭具有類雌激素樣作用，能夠有效防治PMOP。本次實驗通過摘除大鼠卵巢的經典方法復制絕經后骨質疏松動物模型，通過合理隨機對照分組、科學給藥、檢測體質量時序性變化、子宮病理學計量指標、骨密度(BMD)，并與陽性對照藥物進行比較，旨在進一步探究藍刺頭安全性，為傳統中醫藥資源開發及利用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥品、試劑與儀器 藍刺頭制劑由廣州中醫藥大學科技產業園有限公司提供。強骨膠囊：北京岐黃制藥有限公司，規格：0.25 g/粒，批號：20181103。己烯雌酚片：合肥久聯制藥有限公司，規格：0.5 mg/片，批號：20181004。 試劑：蘇木素-伊紅(HE)染液、5%堿性美藍溶液、亞甲基藍染液、乙醚、慶大霉素、酒精、碘酒、4% 甲醛溶液、二甲苯、氨水、PBS緩沖液、石蠟。儀器：3 000 r/min低速離心機，北京醫用離心機廠出品；100倍Olympus SZX19型顯微鏡，日本奧林巴斯公司；圖像分析儀(清華同方Motic Image Advanced 3.0)、隔水式電熱恒溫培養箱、電熱恒溫鼓風干燥箱、冰箱、切片機，內蒙古醫科大學病理學實驗中心；1/1 000電子稱，型號JA503，凱豐集團有限公司；電子計重稱：ACS-H1型，上海海康電子儀器廠。

其他器械：大鼠灌胃器、手術刀、動物手術板、組織剪、斷頭器、尖頭和圓頭鑷、手術用圓針和三棱針、持針器、止血鉗、手術縫合線、無菌洞巾、醫用紗布、棉簽、10 mL注射器、研缽、玻璃棒、燒杯、移液槍槍頭、玻璃鐘罩、10 mL玻璃離心管、載玻片、數據紙、保鮮袋等相關實驗器材。

1.2 實驗動物及飼養環境

4月齡清潔級雌性Wistar大鼠84只，平均體質量(250.00±20.00)g，購于內蒙古大學實驗動物研究中心，合格證號：SCXK(蒙)2002-0001。

大鼠飼養條件一致：內蒙古醫科大學基礎實驗樓病理學實驗室，環境清潔，恒溫、恒濕，室溫(25±2)℃，空氣濕度55%～65%，自然光照明，換氣風扇通風良好，適應性喂養7天；標準鼠飼料喂養(由內蒙古大學實驗動物中心提供)，分籠飼養，自由攝食、水；飼養期間每7日稱1次體重，并每日記錄動物飼養室的溫度變化。

1.3 動物分組及建模

分組：隨機法依次分模型組、假手術組、藍刺頭高、中、低劑量組、強骨膠囊組、己烯雌酚組共7組，每組12只，亞甲基藍染液分別編號。

建立PMOP大鼠模型：方法參照文獻[5]，用乙醚麻醉大鼠后，仰位固定，下腹備皮，鋪無菌洞巾，外科常規消毒，沿下腹部正中線2 cm切口打開腹腔，除假手術組(只切除卵巢周圍少量脂肪，不切卵巢)外，其余各組大鼠均完整摘除雙側卵巢，傷口內滴入適量慶大霉素水溶液，止血后分層縫合。術后各組大鼠切口嚴格消毒。

術后恢復5天，逐只進行陰道上皮細胞角化實驗[6]，連續觀察5天，假手術組大鼠陰道涂片細胞主要由有核上皮細胞、角化上皮細胞和白細胞組成(圖1A)，而模型組則以白細胞為主(圖1B)，提示造模成功。

圖1 光鏡下大鼠陰道脫落細胞涂片

1.3 藥物干預和標本采集

藥物干預：手術造模確認成功后，各組大鼠分籠自由飼養90天后開始給予藥物干預。模型組和假手術組予相應體積0.9%氯化鈉溶液灌胃，藍刺頭高、中、低劑量組按生藥根據人鼠體表面積折算后，分別以13 mg/mL、6.5 mg/mL、3.25 mg/mL的劑量灌胃給藥，以低劑量組為臨床等效劑量；強骨膠囊組3.46 mg/mL、己烯雌酚組0.002 3 mg/mL，按成人有效劑量給藥。為便于配藥，以上藥物根據大鼠體重換算為0.02 mL/g控制給藥量。每天灌胃1次，連續90天，至處死前24 h停止。

標本采集：處死前12 h禁食不禁水，10%水合氯醛0.8 mL腹腔注射麻醉，剖取雙側完整股骨，表面肌肉組織進行剔除分離，保留骨膜，標記右側股骨，生理鹽水浸泡過的紗布包裹，保鮮膜封存，恒溫冷藏保存，以備檢測骨密度(BMD)之用；摘取大鼠子宮，4 ℃室溫4%甲醛溶液固定24 h，以備HE染色。

1.4 指標檢測

1.4.1 右側離體股骨骨密度測定 采用雙能DIREX-10骨密度儀對PMOP大鼠的右側離體股骨近段進行檢測分析。顯微CT掃描大鼠右側股骨近心端，測量骨密度(BMD)、骨小梁體積/組織體積(BV/TV%)。

1.4.2 子宮不同部位病理學檢測 取出固定好的子宮組織，經蒸餾水洗滌→酒精分梯度脫水→二甲苯透明→透蠟→石蠟包埋，改刀修整→切片機橫切面連續切片為4 μm厚度→水浴鍋展片→干凈載玻片貼片→62 ℃烤片3 h→二甲苯脫蠟10 min、梯度酒精、蒸餾水、PBS緩沖液逐級復水→蘇木精-伊紅(HE)染色→中性樹膠封片。

不同組PMOP大鼠各取5張切片(n0)，每張切片隨機再選擇5個視野(n1)，100倍倒置顯微鏡下對子宮內膜上皮細胞高度、子宮內膜腺上皮細胞高度、腺腔內徑、宮內膜腺體面積百分比、肌全層(圖2、表1、表2)變化情況進行觀察，拍照后采用醫學圖像分析系統進行統計。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠體質量時序性變化

表1 各組大鼠造模成型期體質量變化

表2 各組大鼠灌胃治療期體質量變化

表1顯示：模型組與假手術組相比較差異顯著(P<0.01)。表2顯示：模型組與假手術組相比較差異顯著(P<0.01)；藍刺頭高、中、低劑量組與假手術組相比較差別明顯(P<0.05)；強骨膠囊組、己烯雌酚組與模型組相比較區別顯著(P<0.05)；藍刺頭各劑量組、強骨膠囊組、假手術組之間比較差異不明顯(P>0.05)。從整個實驗的終末體質量變化來看，大鼠去卵巢后的體質量時序性變化均呈迅速增長，相比之下經陽性藥物治療后的各去勢組大鼠體質量增長速度減緩，具有顯著差異(P<0.01)，且藍刺頭劑量越大，大鼠體質量越輕，呈線性關系。

2.2 骨組織計量學變化

表3結果顯示，與假手術組比較，各組大鼠股骨頭近心端骨密度(BMD)、骨小梁體積/組織體積(BV/TV%)均下降(P<0.05)，其中模型組降低尤為明顯 (P<0.01)；藥物灌胃干預后，各給藥組與模型組比較，BMD、BV/TV%均顯著升高(P<0.05)；藍刺頭3劑量組之間比較，無統計學意義(P>0.05)，而與己烯雌酚組之間亦無統計學意義(P>0.05)。

表3 右側股骨干骺端骨組織計量學結果比較

2.3 子宮不同部位病理學變化

表4、表5結果顯示，與假手術組比較，模型組的子宮內膜上皮高度、腺上皮高度、腺腔內徑厚度、內膜腺體面積均顯著降低 (P<0.01)。 與模型組比較，藍刺頭中劑量組、強骨膠囊組、己烯雌酚組上述子宮組織各項指標均明顯增加(P<0.05)，而三者之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

圖2顯示，假手術組內膜層較厚，內膜腺腔明顯，全肌層較厚，細胞飽滿，排列致密。與其相比，模型組大鼠子宮內膜層明顯萎縮，內膜腺體面積減少，內膜上皮及腺體上皮高度減小；子宮腺腔內徑厚度變薄，子宮腺減少；全肌層顯著變薄，細胞縮小，排列松散。己烯雌酚組子宮內膜層無顯著變薄，但上皮細胞水腫明顯，部分腺上皮細胞排列不規則，內膜增生過快，尚未見病理惡變；藍刺頭組子宮內膜層雖比正常對照組有不同程度萎縮，但依然較厚，且無細胞水腫現象，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 PMOP大鼠假手術組和模型組子宮不同部位病理切片比較

表4 術后25周子宮內膜上皮細胞高度、子宮內膜腺上皮細胞高度變化

表5 術后25周子宮腺腔內徑厚度、子宮內膜腺體面積百分比變化

3 討論

雌激素在骨代謝中發揮著重要作用，女性絕經或摘除卵巢后，雌激素水平下降、缺乏會加速骨轉換，促使骨形成和吸收偶聯失衡，從而發生骨質疏松。而骨骼和子宮又是雌激素發揮作用的重要靶器官。骨密度(BMD)、骨小梁體積/組織體積(BV/TV%)是骨骼骨量和骨組織結構的主要評價指標，其中 BMD 為骨質疏松癥的黃金診斷指標[7]。子宮是女性重要生殖器官之一和生育場所，存在雌孕激素受體；也是內分泌器官，可分泌前列腺素(PGE)、甲狀旁腺激素相關蛋白(PTH-RP)、腫瘤壞死因子(TNF)、胰島素樣生長因子(IGF)等多種激素和細胞因子。綜上，子宮對參與和調節機體骨代謝有重要意義。

有研究顯示，肥胖會增加身體負重[8]，易導致骨折發生；且肥胖人群體內肌肉含量低，肌肉功能下降甚至受損，增加骨折風險。因此，控制體質量有助于預防骨質疏松。

在蒙醫經典文獻[9]中，骨質疏松屬“骨枯癥”范疇，其記載有“老年人赫依偏盛，體內三根、七素平衡失調，精華分解、吸收與排泄功能紊亂，導致骨之精華吸收減少，易骨枯”。而刺頭是道地的野生傳統蒙藥材，在內蒙古各地隨處可見，能夠壯骨、接骨。

本實驗顯示在一定濃度范圍內，藍刺頭能夠明顯上調去卵巢大鼠BMD、BV/TV%表達水平，從而起到一定的骨保護作用，據前期研究成果[10]推測藍刺頭可能是通過上調骨組織雌激素受體(ER)的表達而發揮類雌激素樣作用；去勢會提高大鼠體質量過快過高增長，會引發肥胖，藍刺頭能有效抑制體質量迅速增長，有助于預防骨質疏松，降低骨折發生風險，其可能也是通過經典雌激素通路實現的；藍刺頭能夠提高子宮質量/體質量(UW/BW)、增加子宮內膜厚度、防止子宮內膜萎縮，延緩了子宮機能下滑狀態，從而在骨量維持方面發揮重要作用。并且與陽性對照藥物比較，藍刺頭組的子宮內膜厚度增長速度不及己烯雌酚組，與強骨膠囊組相比則無明顯差異(P>0.05)，這一結果提示與西藥己烯雌酚相比，藍刺頭的雌激素樣副作用不明顯，其發生子宮內膜癌的風險性可能降低。因此，藍刺頭在防治PMOP的同時，可以有效避免雌激素替代療法給子宮帶來的嚴重不良影響。

綜上，藍刺頭可以對大鼠去卵巢后引發的骨量丟失、體質量過快過高增長和子宮功能衰退起到一定防治作用，證實藍刺頭有效性、安全性較高，并具有簡(組方簡單、給藥量小)、效(有效成分清、效果一定)、驗(理論、實驗依據可靠)、廉(價低)優勢，為應用傳統民族醫藥理論防治絕經后骨質疏松癥提供了一定實驗依據。