抗菌肽Fa-AMP基因的克隆及其原核表達載體的構建

李 蒙，劉 璞，張芝星

(西安文理學院 生物與環境工程學院，陜西 西安 710065)

抗菌肽(Antimicrobial Peptide)是一類具有抗菌活性的小分子多肽的總稱，是由宿主產生的能夠抵抗外界病原體感染，抗菌肽具有廣譜抗菌活性，對細菌有很強的殺傷作用，尤其是其對某些耐藥性病原菌的殺滅作用更引起了人們的重視[1]。廣泛存在于各種生物體內，在微生物、植物和動物體中均有發現并成功分離獲得。直接從生物體內提取抗菌肽產量低、費時長、工藝復雜[2-6]。因此，通過分子生物學技術合成人工抗菌肽是高效制備的理想選擇。

蕎麥(FagopyrumesculentumMoench.)是一種藥食兼用的經濟作物，具有較高的營養價值和保健功能，如防癌、降血糖、降血脂、抗衰老等多種生理功能。其中，蛋白質作為蕎麥中重要的生物活性物質，具有抗菌等不同生理活性[7]。Zhang等[8]將蕎麥抗菌肽編碼基因在原核系統重組表達，表達產物rBT對IM-9細胞系等具有生長抑制活性。趙紅倩等[9]通過Plackett-Burman和Box-hnken試驗并聯優化苦蕎蛋白酶解制備抗菌肽，發現對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有較強的抑制作用。并且發現其不但可以抑制肝癌細胞HepG2、肺癌WRL68、白血病L1210等細胞的生長，甚至可以抑制艾滋病病毒HIV-1的逆轉錄酶活性[10]。因此，蕎麥抗菌肽是多功能活性肽，在抵抗微生物感染、提高機體免疫力等研究領域有著很好的應用前景。

目前，已在多種植物中發現了抗菌肽，Fujimura等[11]首次從甜蕎中分離得到了Fa-AMP1和Fa-AMP2抗菌肽，兩者在結構中十分相似，僅在C端有一個氨基酸差異，具體的分子結構有待進一步闡明。本研究擬通過基因工程手段獲得蕎麥Fa-AMP1和Fa-AMP2抗菌肽的原核表達菌株，為高效制備具有生物活性蕎麥抗菌肽的開發利用提供重要的研究手段。

1 材料與方法

1.1 材料

原核表達載體pET-47b(+)、大腸桿菌BL21(DE3)pLysS和DH5α均由西安文理學院生物與環境工程學院實驗室保存。

1.2 試劑

BamHⅠ、XhoⅠ核酸限制性內切酶，DNA分子量Marker；pGM-T Vector載體；Taq PCR Mastermix；DNA純化試劑盒；質粒提取試劑盒。

1.3 抗菌肽基因設計及引物合成

根據NCBI數據庫中抗菌肽Fa-AMP1(accession P0DKH7.1)和Fa-AMP2(accession P0DKH8.1)蛋白質序列分析，采用大腸桿菌中密碼子偏嗜性設計抗菌肽的核苷酸，Fa-AMP1氨基酸序列(AQCGAQGGGATCPGGLCCSQWGWCG STPKYCGAGCQSNCK)，Fa-AMP2氨基酸序列(AQCGAQGGGATCPGG LCCSQWGWCGSTPKYCGAGCQSNCR)，Fa-AMP1核苷酸序列(5′-GCTC AATGTGGTGCTCAAGGTGGTGGTGCTACCTGTCCTGGTGGT TTGTGTTGTTCTCAATGGGGTTGGTGTGGTTCTACCC CAAAGTACTGTGGTGCTGGTTGTCAATCTAACTGTAA A-3′)；Fa-AMP2核苷酸序列(5′-GCTCAATGTGGT GCTCAAGGTGGTG GTGCTACCTGTCCTGGTGGTTTGTGTTGTTCTCAATGGGGTTGGTGTGGTTCTACCCCA AAGTACTGTGGTGCTGGTTGTCAATCTAACTGTAGA-3′)。

1.4 抗菌肽基因的合成和原核表達載體構建

根據Fa-AMP1和Fa-AMP2優化后的核苷酸序列，設計具有互補重疊區的引物，利用Vector NTI軟件設計的5條互補引物(表1)，分別為Fa1、Fa2、Fa3、Fa4、Fa5引物，采用重疊區擴增基因拼接法，多步PCR獲得目的基因。

Fa-AMP1抗菌肽基因獲得的PCR反應體系(25 μL)：Fa1、Fa2、Fa3、Fa4這4種引物各1 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP(each10 mmol/L)0.5 μL，Pfu DNA酶0.5 μL，ddH2O 17.5 μL。Fa-AMP2抗菌肽基因獲得的反應體系(25 μL)：Fa1、Fa2、Fa3、Fa5這4種引物各1 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP(each10 mmol/L)0.5 μL，Pfu DNA酶0.5 μL，ddH2O 17.5 μL。

PCR程序：94 ℃預變性1 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，循環30次；72 ℃終延伸10 min。反應結束后使用1.0%瓊脂糖凝膠進行DNA電泳分析，產物置于-20 ℃保存。經Tap酶擴增連接到pGM-T Vector載體，轉化到大腸桿菌DH5α,陽性克隆經PCR和測序(上海生物工程公司)鑒定。

表1 合成Fa-AMP基因的引物

Fa-AMP1和Fa-AMP2經測序鑒定正確后，重新設計帶有BamHⅠ和XhoⅠ核酸限制性內切酶的上下游引物，Fa-AMP1和Fa-AMP2的上游引物(5′-ACTCGGGATCCGGCTCAATGTGGTGCTCAAGGTGGTG-3′，下劃線為BamHⅠ酶切位點)，Fa-AMP1的下游引物(5′-ACACCGCTCGAGTTTACAGTTAGATTGACAACCA GC-3′，下劃線為XhoⅠ酶切位點)，Fa-AMP2的下游引物(5′-ACACCGCTCGAGTCTACAGTTAGATTGACAACCAGC-3′，下劃線為XhoⅠ酶切位點)；以測序正確的基因為模板進行PCR擴增，擴增條件：94 ℃預變性1 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s(Fa-AMP1為65 ℃，Fa-AMP2為64 ℃)，72 ℃延伸20 s，循環30次；72 ℃終延伸10 min。使用核酸限制性內切酶對純化的PCR產物和原核表達質粒pET-47b(+)進行雙酶切，酶切后構建重組真核表達載體，轉化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS，對再次重組的表達載體進行測序。

1.5 序列比對與分析

利用ExPASy在線進行氨基酸序列分析(https://web.expasy.org/translate/)，等電點及分子量預測(https://web.expasy.org/protparam/)；在NCBI數據庫中進行氨基酸序列比對；二級結構預測采用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)；空間結構預測采用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)。

2 結果與分析

2.1 目的基因的鑒定

Fa-AMP1和Fa-AMP2抗菌肽基因的多步PCR擴增產物，使用1.0%瓊脂糖凝膠進行DNA電泳分析，由圖1和圖2可知，100～250 bp間有特異性條帶，符合預期結果，連接到pGM-T Vector載體測序結果也表明與實驗前期設計的Fa-AMP1和Fa-AMP2抗菌肽基因一致，在線軟件預測Fa-AMP1和Fa-AMP2的重組蛋白分子量分別為6.49和6.52 kDa，等電點為6.97。

M:DL2000；1～4：Fa-AMP1基因的PCR擴增結果。圖1 Fa-AMP1基因的PCR擴增結果

2.2 基因與載體的酶切

使用核酸限制性內切酶對純化的Fa-AMP1和Fa-AMP2基因和原核表達載體pET-47b進行雙酶切及檢測(圖3和圖4)，酶切成功后進行連接。

2.3 構建重組表達載體

連接轉化后，構建的重組表達載體pET-47b+Fa-AMP1和pET-47b+Fa-AMP2進行PCR鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示(圖5)，100～250 bp間有特異性條帶，符合預期結果，重組表達載體測序結果顯示構建成功。

M:DL2000；1:pET-47b的雙酶切結果。圖4 質粒pET-47b的雙酶切結果

M:DL2000；1：Fa-AMP1重組質粒PCR擴增結果；2：Fa-AMP2重組質粒PCR擴增結果；3：pET-47b+Fa-AMP1重組質粒； 4：pET-47b+Fa-AMP2重組質粒。

2.4 生物信息學分析

獲得基因通過NCBI數據庫中比對，結果顯示氨基酸序列一致，通過SOPMA對Fa-AMP1和Fa-AMP2進行二級結構預測，結果發現在它們的二級結構中α螺旋所占比例為5%和2.5%，β折疊所占比例為15%，無規則卷曲所占比例為80%和82.5%，說明其蛋白的二級結構以β折疊和無規則卷曲為主。利用在線ExpASy的SWISS-MODEL對其進行三級結構預測顯示是多肽的無規則卷曲(圖6)。

圖6 抗菌肽Fa-AMP的三級空間結構預測

3 討論

抗菌肽是生物天然免疫防御系統的重要組成部分，由特定基因編碼，具有廣譜抗菌活性，除了具有抗細菌作用外，還具有抗真菌、抗腫瘤活性、抗病毒、降血壓、免疫調節等功效[12]，它是具有生物學活性的多個氨基酸組成的多肽[13]，深入研究蕎麥小分子活性肽，對于蕎麥蛋白資源的開發利用具有重要的意義。

植物抗菌肽在一級結構方面相當保守序列，即分子內都含豐富的分子內二硫橋，二硫橋是體外合成多肽技術面臨的重要難題[14]。人工合成雖可獲得與天然抗菌肽一致的氨基酸序列，但是常常不能形成正確的空間結構，且成本昂貴，使其僅停留在實驗室試驗階段，同樣，體外分離天然抗菌肽或抗菌蛋白也是費時費力。因此，本次實驗通過基因工程的方法成功構建蕎麥抗菌肽的原核表達載體pET-47b+Fa-AMP1和pET-47b+Fa-AMP2，下一步進行體外表達是短時間得到大量抗菌肽產物的好方法；為獲得具有生物活性的抗菌肽，后續實驗可通過優化誘導表達條件，選擇合適的融合蛋白標簽進行體外表達，是短時間獲得具有生物活性且規模化生產制備抗菌肽的理想選擇。