鹽度馴化下許氏平鲉血清生化指標及滲透壓的變化

成智麗，孫鵬飛，羅 珺,2，沈雙燁，張賽賽，王 偉

( 1.大連海洋大學,遼寧省北方魚類應用生物學與增養殖重點實驗室,遼寧 大連 116023； 2.大連圣亞旅游控股股份有限公司，遼寧 大連 116023； 3.大連市現代農業生產發展服務中心， 遼寧 大連 116023 )

許氏平鲉(Sebastesschlegelii)，屬脊索動物門、輻鰭魚綱、鲉形目、平鲉屬[1]。目前，對許氏平鲉的研究主要集中在基礎生物學[2-4]，消化及組織化學[5]，環境脅迫[6-7]和營養需求[8-9]等方面。我國在20世紀80年代后期人工育苗獲得成功[10]，目前許氏平鲉已經成為我國及日本等周邊國家一種重要的海水網箱養殖種類，具有較高的經濟價值。

鹽度對魚體的影響主要在于生理生化反應、免疫、生長發育、攝食和繁殖等，不同鹽度條件下魚類會表現相互不同的適應狀態[11-15]。目前鹽度脅迫相關研究主要集中在大鱗大馬哈魚(Oncorhynchustshawytscha)[16]、大西洋鮭(Salmosalar)[17]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[18]、眼斑擬石首魚(Sciaenopsocellatus)[11]、墨綠凹鼻鲀(Chelonodonnigroviridis)[19]等魚類中，而關于許氏平鲉的相關研究較少。研究發現，廣鹽性魚類通過調節細胞膜的通透性[19]、營養代謝途徑[20]和機體離子濃度[21]等多種方式來調節滲透壓，以適應水體中鹽度的變化。當環境中鹽度發生變化時，魚類的鰓、腸道和腎臟等器官的滲透壓轉移因子[22-23]、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽S-轉移酶[24]、Na+/K+-ATP酶離子轉移酶[25-26]等物質首先參與調節滲透壓和電解質濃度，使機體形成新的滲透壓平衡以適應環境中鹽度變化。筆者主要對許氏平鲉在鹽度馴化后血清的生化指標及滲透壓變化進行研究，進而為許氏平鲉的養殖生產和海水魚淡化養殖提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用魚捕撈自大連旅順及黑石礁海域，共140尾，均為健康個體。其體質量(94.32±6.41) g，體長(19.13±1.32) cm。

將采集后的試驗魚帶水充氧運回實驗室后，先放在室內(24 ℃左右)暫養7 d。暫養期間，鹽度32，每日8:00投喂1次，飼料日投喂量約為魚體質量的3%，日換水率不少于50%。

1.2 主要儀器和設備

離心機(CT15RE，Hitachi Koki Co.,Ltd.)，電子天平[PL203，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司]，鹽度計(WZ-211，北京萬成北增精密儀器有限公司)，滲透壓儀(OSMOMAT030)，全自動生化分析儀(BS-400，深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)。

1.3 試驗設計

臨床毒理病理變化將生物體反應分為急性期、慢性期和恢復期。因此，根據感染、炎癥、組織損傷等應激原作用于機體后的時間長短，將馴化試驗設計分為在數小時至數日內(急性)和數十日以上(慢性)兩個階段。

1.3.1 急性鹽度馴化試驗

許氏平鲉急性鹽度馴化試驗設置鹽度為30、25、20、15、10、5、4、3、2、0共10個鹽度梯度組，試驗組水體鹽度分別加入生化海水晶進行調節，并使用鹽度計進行測定，每個試驗組另設2個平行，每個平行放魚4尾。此外設置3組陰性海水對照組(鹽度為32)，用以確定試驗用魚健康，對照組不計入死亡率統計。試驗開始將暫養于鹽度為32的海水中的試驗用魚分別放入各試驗組中，觀察并記錄各組在3、6、9、12、24、48、72、96 h許氏平鲉的死亡尾數。急性鹽度馴化試驗階段不進行投喂。

根據Karber氏法的原理，對3、6、9、12、24、48、72、96 h半致死鹽度(LD50)及其安全鹽度(SC)[27]用Excel進行運算。其運算公式為：

lg LD50=∑1/2(Xi+Xi+1)(Pi+1-Pi)

CI=lg-1(lg LD50±1.96×Sm)

SC=(48 h LD50×0.3)/(24 h LD50/48 h LD50)2

式中，Xi為對數劑量，Pi為死亡率，CI為半致死鹽度的95%可信限，Sm為標準誤，d為對數差，n為試驗動物數。

1.3.2 慢性鹽度馴化試驗

將暫養后的試驗魚隨機分成4組，1組為海水對照組(鹽度為32)，另3組為試驗平行組，每組放魚15尾。根據急性試驗馴化所得的半致死鹽度，慢性鹽度馴化的鹽度設置9個梯度，分別為32、30、27、24、21、18、15、12、9，每次按照鹽度梯度由高到低，每隔7 d、每試驗組每槽降低1鹽度后，在第1天的14:00取樣，并進行血清相關生化指標的測定。

1.3.3 試驗管理

試驗用養殖水槽容積為200 L(進行馴化試驗時用阻攔網固定在每個水槽上方，用以防止試驗魚跳出死亡)。試驗期間保持每日換水，低鹽度海水由砂濾海水(鹽度32)和曝氣后的自來水(鹽度0)兌制而成。換水前24 h將水調至試驗所需鹽度并充氣。

慢性鹽度馴化試驗階段每天8:00進行配合飼料投喂，投喂后1.5 h將殘餌及糞便吸出。試驗期間水溫控制在約24 ℃，24 h連續充氣，每隔2 h進行鹽度監測。

1.4 血清制備方法和滲透壓測定

用1 mL注射器自尾靜脈取血，將抽出的血液分為兩份靜置5 h，取血清即待血液凝固后3200 r/min離心10 min，分離上清液。采取冰點下降法，50 μL血清用冰點滲透壓計對試驗魚血清滲透壓進行測定(單位mOsm/kg)。

將剩余制得血清當天送至大連市體檢中心，采用邁瑞BS-400全自動生化分析儀測定谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、乳酸脫氫酶、尿素、總蛋白、血糖、白蛋白、白球比等指標。

1.5 數據處理與分析

用Excel計算許氏平鲉的半致死鹽度及安全鹽度，滲透壓結果用SPSS 19.0進行顯著性分析，以α=0.05作為顯著差異水平。

所有數據均以3個平行試驗組數據的平均值±標準差表示，各組試驗結果采用SPSS 19.0進行單因素方差分析，用Duncan多重比較進行組間差異比較，以P<0.05為差異顯著。

2 結 果

2.1 許氏平鲉在急性鹽度馴化中的半致死鹽度

許氏平鲉在4～30的鹽度內生存良好，當鹽度降至3(包括3)以下時才出現死亡，在鹽度為0的條件下，6 h內試驗魚全部死亡。當鹽度為2和3時試驗魚在48 h內全部死亡。96 h內不同時間的半致死鹽度見表1，48 h與72 h的半致死鹽度一致，根據24 h和48 h的半致死鹽度可以計算出許氏平鲉的安全鹽度，為0.04。

2.2 鹽度馴化許氏平鲉體內滲透壓變化

隨著鹽度不斷的降低，許氏平鲉體內滲透壓出現了2個峰值，分別是鹽度9和鹽度18的條件下，滲透壓分別為(366±48.5) mOsm/kg、(366±48.38) mOsm/kg，峰值也極為接近，低谷出現在鹽度3、鹽度12和鹽度21的條件下，但是鹽度3以下滲透壓變化劇烈出現最低值，滲透壓為(173.3±4.51) mOsm/kg，明顯下降。在鹽度24～32條件下，試驗魚體內滲透壓比較平穩，無明顯差異(圖1)。

表1 96 h內不同時間的半致死鹽度Tab.1 Median-lethal salinity at different times within 96 h

圖1 不同鹽度馴化下許氏平鲉滲透壓的變化規律Fig.1 Variations in osmotic pressure in Schlegel′s black rockfish S. schlegelii under different salinity acclimation

2.3 慢性鹽度馴化對許氏平鲉血清生化指標的影響

2.3.1 谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶和乳酸脫氫酶活性的變化規律

谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶和乳酸脫氫酶活性的試驗結果見圖2。許氏平鲉在鹽度降至24時谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶和乳酸脫氫酶均呈現高值，其活性分別為(68.67±3.51)、(18.67±3.06) U/L和(726±27) U/L。谷草轉氨酶在鹽度降至21以下時，活性一直較低，海水對照組(鹽度32)谷草轉氨酶活性與鹽度30、24組差異不顯著(P>0.05)，但與其余鹽度組差異顯著(P<0.05)。隨著鹽度的改變，谷丙轉氨酶活性呈上下波動的現象，鹽度27、24、21、15組與海水對照組差異顯著(P<0.05)。乳酸脫氫酶活性隨著鹽度的降低呈先降后升再降再升的變化趨勢。鹽度27、24、15、9組的乳酸脫氫酶活性和海水對照組差異顯著(P<0.05)。

圖2 鹽度變化對許氏平鲉血清中谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、 乳酸脫氫酶活性的影響Fig.2 Effects of salinity on activities of glutamic-oxaloacetic transminase (GOT), glutamic-pyruvic transaminase (GPT) and lactic acid dehydrogenase in Schlegel′s black rockfish S. schlegelii

2.3.2 尿素的變化規律

尿素濃度隨著鹽度的不斷降低而呈現下降趨勢，各個鹽度組和海水對照組差異顯著(P<0.05)(圖3)。在鹽度為9時達到最低值，為(0.68±0.06) mmol/L。

圖3 鹽度變化對許氏平鲉血清尿素濃度的影響Fig.3 Effects of salinity change on serum urea (UREA) concentrations in Schlegel′s black rockfish S. schlegelii

2.3.3 總蛋白和白蛋白的變化規律

總蛋白和白蛋白質量濃度隨著鹽度的降低，上下波動的幅度不大(圖4)。總蛋白質量濃度在鹽度為21時達到最低值，與海水對照組差異顯著(P<0.05)。而白蛋白質量濃度在鹽度為24時達到最低值，并與海水對照組有顯著差異(P<0.05)。

圖4 鹽度變化對許氏平鲉血清總蛋白和白蛋白質量濃度的影響Fig.4 Effects of salinity on serum total protein and albumin concentrations in Schlegel′s black rockfish S. schlegelii

2.3.4 血糖的變化規律

許氏平鲉的血糖濃度在鹽度降到24時呈現峰值(圖5)，為(6.04±0.16) mmol/L，與其余各鹽度組差異顯著(P<0.05)。血糖濃度在鹽度為21時出現最低值，和海水對照組差異不顯著(P>0.05)，但是總體上隨鹽度降低而呈升高的趨勢。

圖5 鹽度變化對許氏平鲉血液中血糖濃度的影響Fig.5 Effects of salinity change on the level of plasma glucose in the blood of Schlegel′s black rockfish S. schlegelii

2.3.5 白球比的變化規律

各鹽度組的白球比隨著鹽度的降低上下波動不大，各組和對照組比較均無顯著差異(P>0.05)(圖6)。

圖6 鹽度變化對許氏平鲉血液中白球比的影響Fig.6 Effects of salinity change on the ratio of A/G in the blood of Schlegel′s black rockfish S. schlegelii

3 討 論

3.1 比較急性鹽度馴化和慢性鹽度馴化

急性鹽度馴化條件下，許氏平鲉在鹽度4、5、10、15、20、25、30時96 h內均可以存活；慢性鹽度馴化條件下，當鹽度繼續降低到3時，出現多種不適應狀態。當鹽度超出許氏平鲉調節范圍時就會死亡。對咸海卡拉白魚(Chalcalburnuschalcoidesaralensis)[28]的試驗結果表明，咸海卡拉白魚在鹽度為9.38的水中60 d存活率為87.5%，鹽度低于11.32的試驗組30 d存活率為100%，60 d為75%，而在鹽度為13.62的水體中，24 h內魚體全部死亡，鹽度高于15，12 h死亡率高達100%。咸海卡拉白魚屬鯉科，為淡水魚，對于鹽度變化非常敏感，自身滲透壓調節機制無法滿足其在高鹽度水體中正常生活。沈雙燁等[29]對鯉魚(Cyprinuscarpio)鹽度馴化的試驗結果顯示，鹽度0～12時，魚體生存良好，3 h內鹽度到14時開始出現死亡，說明鯉魚作為淡水魚對高鹽度水體敏感，而對低鹽度水體耐受。胡發文等[30]對大瀧六線魚(Hexagrammosotakii)的研究表明，大瀧六線魚幼魚在低鹽度水體中出現明顯的不適反應并死亡，在鹽度為30時，存活率最高。王曉雯等[31]對雜交鱘(Husodauricus♀×Acipenserschrenckii♂)幼魚的研究亦顯示，鹽度變化會引起魚體反應。以上研究結果與本試驗結果均說明，水體的鹽度變化對魚體的存活與生長影響顯著。

3.2 許氏平鲉鹽度馴化滲透壓的變化

魚類對鹽度的適應主要分為被動的環境適應和主動的調節恢復兩個階段。在鹽度逐漸降低的條件下，試驗魚體內滲透壓先應激降低適應環境，但鹽度繼續降至18時，魚體內滲透壓升高，進行主動調節適應以維持內環境穩定。本試驗雖未測定Na+/K+-ATP酶離子轉移酶活性，但是得到了與對日本鰻鱺(Anguillajaponica)[32]以及對花鱸(Lateolabraxmaculatus)[33]滲透壓變化相一致的數據趨勢，這表明許氏平鲉在鹽度變化條件下體內滲透壓調節機制可能與上述研究對象相似。也顯示出許氏平鲉具有一定的滲透壓調節能力。

3.3 許氏平鲉鹽度馴化各生化指標的變化

魚類血清生化指標可以作為生物監測和環境毒理學的參考標志物。指標觀測值的變化反映了魚類對環境改變的適應程度。因此，評價魚類健康和環境監測方面魚類血液生化指標具有潛在的應用價值[34]。

一般在水生動物體內正常生理狀態下谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶活性處于較低水平，當機體受脅迫時從肝細胞釋放到血液中，常作為環境脅迫特別是毒性試驗的檢測指標[35]，可用于指示水生生物健康及脅迫程度[36]。本試驗中，鹽度21時許氏平鲉血清中谷丙轉氨酶含量最低，說明這個鹽度下魚體內肝細胞的細胞通透性不強，細胞損傷不大，而在鹽度15、24、30、32下生長的許氏平鲉，魚體內細胞損傷強度明顯處于最高峰。這些說明慢性鹽度馴化過程對許氏平鲉的脅迫比較大，這可能是一種適應性生理性的變化；另外，據王曉杰等[6]研究結果，不排除內臟組織已經出現病變的可能。

乳酸脫氫酶是糖酵解酶，可催化乳酸脫氫生成丙酮酸。而乳酸是作為魚類對外界脅迫的應激反應的間接指標。有研究指出，環境脅迫引起魚類的初級反應為內分泌變化，如兒茶酚胺和皮質類固醇的升高，隨之刺激血液中葡萄糖和乳酸的增加[37]。本試驗雖未檢測血清中乳酸的含量，但可以通過乳酸脫氫酶的變化規律來推測血清中乳酸的變化規律。本試驗中，許氏平鲉的乳酸脫氫酶隨著鹽度的變化呈現先降后升再降的變化趨勢，因此，可以推測出許氏平鲉血清中乳酸亦是以這個趨勢顯著發生變化的(P<0.05)，在鹽度24的時候出現高值，可能說明，在鹽度24～32內許氏平鲉乳酸隨著鹽度的持續升高而降低。

魚類屬于排氨動物，尿素是蛋白質代謝的終產物。馮廣朋等[36]通過研究溫度對中華鱘代謝酶等的影響中指出尿素的指標常被用來評估腎臟和鰓的功能。有研究顯示，在饑餓狀態下的不同魚類尿素的排放規律不一致，呈現下降或上升的趨勢[38-39]。在本試驗中，隨鹽度的降低許氏平鲉尿素濃度呈下降趨勢。本試驗結果與江麗華等[40]對褐菖鲉(Sebastiscusmarmoratus)的研究結果相似，由于魚的種類不同，尿素的排放規律也不同。

研究顯示，血糖和總蛋白水平受蛋白質分解代謝和肝糖原分解的影響[41-42]，當生物體處于慢性鹽度馴化時，糖類首先迅速被用于供能，碳水化合物以單糖形式進入血液，從而使血糖濃度升高[40]。除了受胰島素和腎上腺素控制外，血糖還受機體的多種方式調節，因而在機體中血糖總量處于動態平衡中，但也極易受其他脅迫因子的影響[43-45]，比如水環境、饑餓等。李懋等[46]認為，魚在受傷或饑餓狀態時血糖水平會降低。本試驗中，許氏平鲉在慢性鹽度脅迫下血糖水平與鹽度呈負相關。因此，可能是由于鹽度變化后組織對葡萄糖的利用率降低，導致血糖濃度升高，也可能是滲透機制調節中的高能量需求而使組織糖原異生作用增強，導致血糖濃度升高[47]；在鹽度9～21內，可能推測許氏平鲉在這個鹽度環境下，運動強度升高，導致血液中血糖濃度降低；在高鹽度環境如鹽度27～32下血糖濃度的降低可能是由于鹽度的突變對許氏平鲉刺激性加強，而魚類機體主要是通過自身血糖代謝和無氧代謝所產生的糖質來提供所需能量[48]，故而大量消耗體內葡萄糖。

另有研究指出，白球比與血漿膠體滲透壓相關，且白球比與血漿膠體滲透壓成正相關[49]。在本試驗中，許氏平鲉的白球比均呈現上下略微波動的現象。說明很長一段時間內血清的白球比在受鹽度脅迫后都是相對穩定的。