光棘球海膽體腔液調理素樣分子的研究

婁 越，陳 丹，常亞青，叢玉婷，王連順，李丹彤

( 大連海洋大學，農業農村部北方海水增養殖重點實驗室，遼寧 大連 116023 )

光棘球海膽(Strongylocentrotusnudus)，又稱大連紫海膽，屬棘皮動物門、海膽綱、球海膽科，為中國主要海膽類養殖經濟物種[1]。作為我國可食用和藥用的海膽種類之一，光棘球海膽的養殖相關問題逐漸成為試驗研究的重點[2-3]。目前海膽養殖病害防治的主要方法是抗菌素治療，但過度使用抗生素會導致細菌產生抗藥性[4]。因此研究光棘球海膽免疫機制，有助于海膽類生物病害防治機理研究。

棘皮動物只有非特異性免疫系統，由體腔細胞和體液免疫因子組成，吞噬細胞為其中重要的一種[5]。機體內起到促進吞噬作用的物質總稱為調理素，能夠幫助吞噬細胞吞噬和清除抗原抗體[6]，構筑體內免疫防線。目前，已在貝類[7]、海星[8]、海膽[9]和海參[10]等水產養殖動物中證實了在病原體周圍有促進吞噬作用的物質存在。麥康森等[11]在對仿刺參(Apostichopusjaponicus)體腔液的研究中發現，調理素樣分子在機體受到免疫刺激時分子水平會增加。張穎等[12]在蝦夷馬糞海膽(Strongylocentrotusintermedius)體腔液中發現了分子質量為250.62 ku的調理素樣分子。張揚等[13]在長牡蠣(Crassostreagigas)中分離出一種新型貝類調理素DCP，具有強烈的促進血淋巴細胞吞噬的作用。目前光棘球海膽體腔液調理素的相關研究較少。

筆者測定在不同反應基質中等量光棘球海膽吞噬細胞對不同處理的酵母細胞的吞噬率，比較分析從受調理酵母細胞和非調理酵母細胞以及光棘球海膽無細胞體腔液這3種成分中提取分離出來的樣品的電泳結果，提取收集光棘球海膽無細胞體腔液調理素樣分子并進行功能測定。對光棘球海膽調理素樣分子的試驗，有利于研究其免疫機制，為進一步實現光棘球海膽的病害防治和健康養殖提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

光棘球海膽購于大連黑石礁早市，平均體質量(80.9±1.9) g，海水溫度15～18 ℃，16頭光棘球海膽于大連海洋大學重點實驗室100 cm×50 cm×60 cm 30 L充氣水槽中養殖7 d后進行試驗，每日換水1次。

1.1.2 酵母細胞懸液[14]

將100 mg酵母懸于0.5 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)，沸水浴加熱30 min，磷酸鹽緩沖液沖洗后4000 r/min離心10 min，過程中磷酸鹽緩沖液的添加量需低于離心管的2/3，沖洗離心6次，磷酸鹽緩沖液稀釋至體積比為1∶90。

1.1.3 吞噬細胞

用注射器從新鮮光棘球海膽的圍口腔內抽取7～8 mL體腔液加入離心管，再加入等體積的無菌海水后1000 r/min離心5 min，取其沉淀加入1 mL無菌海水稀釋，顯微鏡觀察確保有吞噬細胞存在，放入4 ℃冰箱保存。

1.1.4 光棘球海膽無細胞體腔液、調理素樣分子

用0.22 μm的濾膜過濾抽取出來的光棘球海膽體腔液至少5遍，取10 μL在顯微鏡下觀察，直到吞噬細胞被全部過濾掉，即為光棘球海膽無細胞體腔液，放在4 ℃冰箱保存，用透析膜透析60 h，之后通過平衡過的葡聚糖G-200柱進行層析，收集調理素樣分子。

1.1.5 酵母細胞吸附的無細胞體腔液、受調理的酵母細胞

3.5 mL酵母細胞懸液和3 mL無細胞體腔液混合，常溫培養1 h，8000 r/min離心10 min,得到的沉淀是吸附了調理素的酵母細胞，上清液是經酵母細胞吸附過調理素的光棘球海膽無細胞體腔液。將下層沉淀換到小離心管中，再進行一次離心后得到受調理的酵母細胞。

1.2 方法

1.2.1 不同反應基質對光棘球海膽吞噬細胞吞噬活性影響的測定

試驗分4組進行，前3組分別在2 mL光棘球海膽吞噬細胞里加2 mL磷酸鹽等滲緩沖液、經酵母細胞吸附過的無細胞體腔液和光棘球海膽無細胞體腔液，每組各加入1 mL酵母細胞懸液；第4組在2 mL光棘球海膽吞噬細胞里加2 mL等滲緩沖液和1 mL受調理酵母細胞；4組均于常溫培養2 h，多次振蕩試管后，顯微鏡下觀察并測定不同的反應基質里等量光棘球海膽吞噬細胞對不同處理的酵母細胞的吞噬率。每完成1次計數后再換1組海膽抽取體腔液，再重復上述試驗2次。

吞噬率為100個吞噬細胞中吞噬酵母細胞數的百分比[15]。

1.2.2 樣品的制備及SDS-PAGE分析

制備3種樣品并進行SDS-PAGE分析[16]。制備出受調理酵母細胞所提取的里面含有調理素樣分子成分的樣品：0.5～1.0 mL磷酸鹽緩沖溶液洗滌受調理酵母細胞后，加200 μL 1% 十二烷基硫酸鈉(SDS)，在沸水浴加熱5 min，4000 r/min離心5 min，收集上清液；制備出非調理酵母細胞所提取的不含調理素樣分子成分的樣品：0.5～1.0 mL磷酸鹽緩沖溶液洗滌非調理的酵母細胞后，加200 μL 1%十二烷基硫酸鈉，在沸水浴加熱5 min，4000 r/min離心5 min，收集上清液；制備其中含有調理素樣分子成分的光棘球海膽無細胞體腔液的樣品。3種樣品分別進行電泳后，染色1 h，清洗3次，最后加脫色液。

1.2.3 調理素樣分子的純化及SDS-PAGE分析

用截留分子量3.5 ku的透析膜將抽取出來的光棘球海膽體腔液在4 ℃冰箱透析60 h，每隔15 h換透析液1次，之后通過平衡過的葡聚糖G-200柱(1.6 cm×90 cm)進行層析[17]，3.0 mL/10 min流速加緩沖液洗脫，280 nm紫外分光檢測，對峰值進行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.4 調理素樣分子功能的測定

分別加入2.0、1.5、1.0、0.5 mL等滲緩沖液，再分別加入0、0.5、1.0、1.5 mL經純化的調理素樣分子, 每支試管中再加1.0 mL吞噬細胞和1.0 mL酵母細胞懸液,15 min振蕩1次，使其完全混勻，室溫培養2 h，用顯微鏡測定吞噬率。

1.2.5 數據處理

采用SPSS 13.0軟件進行t檢驗，結果表示為平均值±標準差，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 不同反應基質里光棘球海膽吞噬細胞的吞噬率

光棘球海膽吞噬細胞分別在等滲緩沖液、經酵母細胞吸附過無細胞體腔液、光棘球海膽無細胞體腔液對非調理的酵母細胞和在等滲緩沖液中對受調理的酵母細胞的吞噬率之比為1.00∶1.17∶2.00∶1.71，對照組與其他3個試驗組均有極顯著差異(P<0.01)，這表明光棘球海膽體腔液中可能存在某種調理素樣分子，能夠提高吞噬細胞吞噬活性，其中等滲緩沖液中光棘球海膽的吞噬細胞對受調理的酵母細胞的吞噬率是對非調理的酵母細胞的1.71倍，這可能是光棘球海膽體腔液的調理素樣分子被吸附在酵母細胞表面，從而增強了吞噬作用(圖1)。

圖1 不同反應基質吞噬細胞的吞噬率Fig.1 The rate of phagocytosis in different reaction media 1.PBS等滲緩沖溶液+非調理酵母細胞； 2.經酵母吸附的無細胞體腔液+非調理酵母細胞； 3.無細胞體腔液+非調理酵母細胞； 4.PBS等滲緩沖溶液+受調理酵母細胞. 1.the PBS isotonic buffer + no regulating yeast cells； 2.the cell free coelomic fluid by yeast cell adsorption + no regulating yeast cells； 3.the cell free coelomic fluid+no regulating yeast cells； 4.the PBS isotonic buffer + regulating yeast cells.

2.2 SDS-PAGE分析

將3種提取出的樣品進行電泳，受調理酵母細胞提取出的含調理素樣分子成分的樣品在200.00 ku下方顯示為1個明顯條帶(圖2a)。非調理酵母細胞提取出的不含調理素樣分子成分的樣品，其對應位置并沒有顯示出條帶(圖2b)，含調理素樣分子的光棘球海膽無細胞體腔液成分，在200.00 ku下方同樣顯示出一個明顯的條帶，由于光棘球海膽無細胞體腔液內除了調理素樣分子之外還有其他的蛋白質，因此有多個條帶(圖2c)。由此可見，光棘球海膽體腔液應該存在某種調理素樣分子，能夠被酵母細胞吸附(圖2)。通過測定電泳圖相對遷移率，得出分子質量約為149 ku(圖3)。

圖2 光棘球海膽體腔液調理素樣分子的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of opsonin-like molecule in coelomic fluid of sea urchin S. nudus M.蛋白質marker；a.受調理酵母細胞提取的成分； b.非調理酵母細胞提取的成分； c.光棘球海膽無細胞體腔液. M.protein marker;a.the composition seperated from regulating yeast cells; b.the composition seperated from no regulating yeast cells; c.no cell coelomic fluid of sea urchin S. nudus.

圖3 Marker的分子質量標準曲線Fig.3 Molecular weight standard curve of marker

2.3 調理素樣分子純化結果

光棘球海膽無細胞體腔液經透析和SephadexG-200凝膠過濾層析，收集流下來的50管液體中紫外分光檢測出現1個峰值(圖4)，其峰值樣品的電泳顯示，200.00 ku下方呈現為1個明顯條帶(圖5)。測定電泳圖相對遷移率，得出分子質量約為156 ku(圖6)。

圖5 純化的調理素樣分子的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of purified opsonin-like molecule in celll-free coelomic fluid of sea urchin S. nudus M.蛋白質marker；a.30 μL純化調理素樣分子； b.40 μL純化調理素樣分子； c.50 μL純化調理素樣分子. M.protein marker;a.30 μL purified opsonin-like molecule; b.40 μL purified opsonin-like molecule; c.50 μL purified opsonin-like molecule.

圖6 Marker的分子質量標準曲線Fig.6 Molecular weight standard curve of marker

2.4 調理素樣分子的功能測定分析

將光棘球海膽無細胞體腔液經過提取分離后得到調理素樣分子，等滲緩沖溶液中，測定其在不同添加量不同時間點，對光棘球海膽吞噬細胞的吞噬活性的影響程度。試驗結果表明，添加0.5、1.0、1.5 mL經純化調理素樣分子的試驗組的吞噬率均高于對照組(圖7)。反應開始15、30、45、60 min 4個時間點分別測定3種不同添加量的調理素樣分子對光棘球海膽吞噬細胞的吞噬活性的影響結果(圖8)。提取的光棘球海膽體腔液調理素樣分子能夠明顯提高光棘球海膽吞噬細胞的吞噬能力，反應60 min時，0.5、1.0 mL和1.5 mL組與對照組均有極顯著差異(P<0.01)，調理素樣分子含量越高，越能促進光棘球海膽吞噬細胞的吞噬活性。

圖7 不同添加量調理素樣分子溶液中吞噬細胞的吞噬率Fig.7 The rate of phagocytosis of opsonin-like molecule in different addition amount

圖8 各時間點含調理素樣分子的溶液中吞噬細胞的吞噬率Fig.8 The rate of phagocytosis in opsonin-like molecule fluid at different time

3 討 論

3.1 光棘球海膽調理素樣分子的免疫機制

棘皮動物沒有專門的循環器官，通過體腔膜細胞的纖毛擺動在體腔液中進行營養物質的運輸，體腔液中的體腔細胞具有吞噬作用。調理素樣分子是能夠促進吞噬細胞作用的一種蛋白質，是一條連接吞噬細胞和異物的“橋梁”[18]，在棘皮動物免疫系統中是重要的一部分。通過對光棘球海膽的體腔吞噬細胞在不同基質里吞噬率的不同，證明了光棘球海膽體腔液中存在刺激吞噬細胞作用的調理素樣分子，能夠標記酵母細胞，增強吞噬細胞活性，從而調節免疫的進程。

本試驗中，提取的光棘球海膽體腔液調理素樣分子的分子質量約為156 ku，與張穎等[12]在蝦夷馬糞海膽體腔液中提取出的調理素樣分子分子質量(250.62 ku)不同。在等滲緩沖液、經酵母細胞吸附過無細胞體腔液以及光棘球海膽無細胞體腔液這3種不同反應基質，本試驗結果與已有研究結果一致，光棘球海膽的無細胞體腔液基質吞噬率最高，可知其中存在某種調理素樣分子和未知物質，共同促進吞噬細胞的吞噬作用。在等滲緩沖溶液光棘球海膽吞噬細胞對非調理和受調理酵母細胞的吞噬能力有差異，是由于在受調理酵母細胞表面吸附了某種調理素樣分子，能起到增強吞噬細胞活性的作用。

3.2 調理素樣分子的純化

調理素在外來物質入侵生物時對其進行標記，幫助生物機體的吞噬細胞能夠精準識別并清除外來物質。國內外研究表明，已在多種海參、海膽[11-12]的體腔液中發現調理素的存在，并通過透析和層析提取出調理素樣分子進行了功能測定。筆者將這方面研究較少的光棘球海膽作為試驗對象，從受調理酵母細胞和非調理酵母細胞以及光棘球海膽無細胞體腔液這3種不同成分提取的樣品進行SDS-PAGE分析，其結果再次確定了光棘球海膽體腔液中有調理素樣分子的存在，調理素樣分子能夠吸附于酵母細胞的表面，含調理素樣分子成分的樣品進行電泳時均在200.00 ku下方顯示有1個明顯條帶。

對光棘球海膽體腔液調理素樣分子進行提取純化的試驗過程，參考了刺參凝集素[19]和蝦夷馬糞海膽體腔液調理素[12]的提取工藝。將光棘球海膽無細胞體腔液用透析膜在4 ℃冰箱透析60 h，之后通過平衡過的葡聚糖G-200柱進行層析，小管收集流下來的液體，用紫外分光光度計在280 nm下進行檢測，結果發現，液體對光的吸收度出現1個峰值，峰值處即為純化的調理素樣分子，進行電泳分析后得出其分子質量約為156 ku，說明光棘球海膽體腔液內調理素樣分子的分子質量約為156 ku。

3.3 光棘球海膽調理素樣分子的功能性質

調理素是生物體內一類促進吞噬作用的蛋白質，能夠幫助清除體內的病原體，參與炎癥反應[20]，維持體腔液環境穩態[21]。目前對調理素的相關試驗不斷進行，已經在多種水產養殖動物中發現了促進吞噬作用的物質存在[7-10]。筆者通過測定光棘球海膽吞噬細胞在不同介質里對不同處理的酵母細胞的吞噬率，確定了光棘球海膽體腔液中有增強吞噬細胞活性的物質存在，經過透析和層析將調理素樣分子提取純化出來，計算得出其分子質量約為156 ku。

將純化的光棘球海膽調理素樣分子進行功能測定，在反應開始15、30、45、60 min 4個時間點測定分別添加0.5、1.0、1.5 mL的調理素樣分子對光棘球海膽吞噬細胞的吞噬活性的影響程度。等滲緩沖溶液中，在一定添加量范圍內，4個時間點調理素樣分子添加量越高，光棘球海膽吞噬細胞的吞噬率越大。說明光棘球海膽體腔液的調理素樣分子能增強吞噬細胞的吞噬活性，幫助吞噬細胞對體腔液外來物質進行清除，并且調理素樣分子的添加量能夠影響吞噬進程，一定范圍內，當添加量增加時，能夠刺激更多的體腔吞噬細胞參與免疫反應。