夏季仿刺參養殖池塘水體菌群地域性特征及其影響因素

楊小佩，王 犖，徐翰晨，丁 君，常亞青，郝振林

( 大連海洋大學，農業農村部北方海水增養殖重點實驗室，遼寧 大連 116023 )

仿刺參(Apostichopusjaponicus)由于具有豐富的營養和藥用價值，深受消費者青睞，是我國北方主要的海水養殖品種之一[1]。近年來，我國仿刺參養殖產業迅猛發展，池塘養殖已然成為仿刺參增養殖的重要模式[2-3]。養殖池塘生態系統是一種復雜的水域生態系統，微生物群落的結構和功能在養殖環境中扮演著重要的角色，對維持水域生態系統穩定、水質調控、疾病防控等方面均具有重要的作用[4-6]。因此，保持水產養殖生態系統微生態平衡，對于防治養殖環境惡化及促進養殖生物健康生長尤為關鍵[7-8]。

水產養殖池塘微生物群落具有系統特異性，而當前關于養殖池塘生態系統微生物群落地域差異性相關方面的研究工作仍然相對匱乏。已有的研究表明，內部因子和外部因子是主導養殖池塘生態系統微生物群落結構和功能的兩大因素[9-10]。內部因子主要是指食物網中各物種之間的相互作用；外部因子主要是指養殖環境的理化因子，如營養鹽、溫度、鹽度等[11]。其中，外部理化因子是影響水域生態系統菌群結構的重要因素，季節的變動、營養物質的輸入等變化均可造成養殖環境菌群種類和豐度的改變，進而影響養殖生物的生長及健康[12-13]。

為解析仿刺參養殖池塘水體微生態系統的穩定性，筆者以中國北方典型岸基半開放仿刺參養殖池塘為研究對象，利用高通量測序技術，揭示不同地區仿刺參養殖池塘水體菌群地域性差異和共性，并初步探討水體菌群與其生境環境因子間的相互關系，進一步查明影響水體菌群結構的主導環境因子，以期為仿刺參養殖池塘的精準化管理和綠色健康養殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選取長海、營口、樂亭和乳山作為北方典型岸基半開放仿刺參養殖池塘(圖1)，池塘水深2～3 m，水域面積約0.1 km2，底質均為泥質，水源來自于近海海域，利用潮汐帶來的潮差進水和排水。選取的仿刺參養殖池塘僅養殖仿刺參單一品種，全年不投喂飼料及益生菌，保證仿刺參自然生長。

每個仿刺參養殖池塘均設置4個采樣點，利用有機玻璃采水器，于2018年8月采集上層(離水面30 cm處)和下層(離池底30 cm處)水樣各5 L，混勻。一部分水樣經0.45 μm濾膜抽濾，用于水質指標檢測；另一部分經0.22 μm醋酸纖維素濾膜抽濾后放置于無菌離心管中液氮保存，用于細菌總DNA的提取。不同地區仿刺參養殖池塘水體各項水質指標和細菌群落高通量測序樣品，均設置3個平行。

圖1 采樣點示意Fig.1 Sampling locations

1.2 環境因子測定

采用HACH(HQd)水質分析儀器(美國HACH公司)，現場測定溫度、鹽度、溶解氧、氧化還原電位(ORP)和pH。其他理化水質參數測定方法按照GB 17378—2007《海洋監測規范》進行。

1.3 DNA提取

選用OMEGA Soil DNA試劑盒提取仿刺參養殖池塘水體樣品總DNA，為確保DNA無降解、無污染，DNA樣品質量濃度要求≥50 ng/μL，純度要求260 nm吸光度/280 nm吸光度(D260/D280)=1.8～2.0。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA，條帶清晰完整無拖尾，質量合格。

1.4 PCR擴增與測序

細菌16S rRNA基因V3～V4片段的擴增引物為341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′)，應用Illumina MiSeq測序平臺完成序列測序。

1.5 數據分析

測序數據進行預處理生成優質序列后，在97%相似水平下，采用Vsearch軟件進行運算分類單元(OTU)聚類得到運算分類單元。使用QIIME軟件包挑選出各運算分類單元的代表序列，并將所有代表序列與SILVA數據庫比對進行物種注釋，保留置信區間大于0.7的注釋結果。使用R軟件進行細菌多樣性及聚類分析?；贐ray-Crutis算法構建樣品菌群結構圖。選用SPSS 19.0軟件中單因素方差分析進行多樣本顯著性差異分析(α=0.05)。

2 結 果

2.1 高通量測序結果

4個地區仿刺參養殖池塘12個水體樣品共測得原始序列558 090條，過濾掉低質量和短長度序列，去除嵌合體序列后，共獲得有效序列444 373條，聚類于14 544個運算分類單元。長海、營口、樂亭和乳山地區水體樣品中運算分類單元數目分別為1045±78、1351±453、1239±400和1213±132。組間平均測序覆蓋率均為97.83%～98.45%，能夠真實反映樣本菌群組成情況。

2.2 菌群α多樣性分析

不同地區仿刺參養殖池塘水體菌群α多樣性指數表明，營口和乳山地區仿刺參養殖池塘水體菌群豐富度(以ACE指數和Chao1指數衡量)顯著(P<0.05)高于樂亭和長海，長海仿刺參養殖池塘水體菌群豐富度最低；營口地區仿刺參養殖池塘水體菌群多樣性(以Shannon指數和Simpson指數衡量)顯著高于其他3個地區(P<0.05)(表1)。

表1 水體菌群α多樣性指數Tab.1 Alpha diversity index of bacterial community in the water of sea cucumber culture ponds

2.3 優勢菌群結構特征分析

不同地區仿刺參養殖池塘水體菌群結構特征見圖2。根據物種注釋結果，4個地區仿刺參養殖池塘水體的細菌群落共有33門、50綱、75目、159科、532屬。在門水平上，不同地區仿刺參養殖池塘水體優勢菌群主要隸屬于變形菌門和擬桿菌門，二者相對豐度占比68.64%～89.34%。其中，變形菌門作為水體第一優勢菌門，相對豐度占比51.10%～71.98%。不同地區水體次優勢菌門存在顯著性差異，長海、乳山和樂亭次優勢菌門均為擬桿菌門，相對豐度占比分別為26.46%、23.01%和17.35%；營口次優勢菌門為放線菌門，相對豐度為18.54%。長海、乳山和樂亭第三優勢菌門均為放線菌門，相對豐度占比分別為11.15%、8.98%和8.04%，營口的第三優勢菌門為擬桿菌門，相對豐度為17.57%。

在屬水平上，玫瑰變色菌屬(Roseovarius)、Kiloniella、遠洋桿菌屬(CandidatusPelagibacter)、棕囊藻桿菌屬(Phaeocystidibacter)為不同地區仿刺參養殖池塘水體的優勢菌屬，其次為假單胞菌屬(Pseudomonas)、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)和Pseudohongiella。其中，長海、乳山和樂亭地區仿刺參養殖池塘水體第一優勢菌群均隸屬于玫瑰變色菌屬，相對豐度占比分別為18.68%、

圖2 不同地區仿刺參養殖池塘水體菌群結構特征Fig.2 Characteristics of bacterial community in the water of sea cucumber culture ponds in different areas

24.46%和24.65%。然而，營口地區仿刺參養殖池塘水體第一優勢菌群則隸屬于Kiloniella，相對豐度占比為23.07%。樂亭和乳山地區仿刺參養殖池塘水體次優勢菌群均隸屬于遠洋桿菌屬，相對豐度占比分別為11.57%和13.80%；長海和營口地區仿刺參養殖池塘水體次優勢菌屬分別為Planktomarina和玫瑰變色菌屬，相對豐度占比分別為12.88%和6.36%。

2.4 差異菌群結構特征分析

利用Weighted Unifrac距離矩陣，對不同地區仿刺參養殖池塘水體菌群結構相似性進行聚類分析(圖3)。其中，樂亭與乳山水體菌群結構相似度最高首先聚為一類，其次與長海聚為一類，營口地區則單獨聚為一類。研究表明，夏季不同地區仿刺參養殖池塘水體菌群結構具有地域性差異，營口水體菌群結構顯著有別于其他3個地區。

圖3 不同地區仿刺參養殖池塘水體菌群聚類分析Fig.3 Cluster analysis of bacterial community in the water of sea cucumber culture ponds in different areas

為進一步探究營口地區仿刺參養殖池塘水體菌群結構的地域性差異，在空間維度上對不同地區仿刺參養殖池塘水體菌群進行線性判別LEfSe分析，以查明不同地區所對應的顯著性特異菌群(P<0.05)?；贚DA判別值大于3.5的判定標準，共有不同分類水平的68個細菌類群在4個地區之間存在顯著性差異(圖4)。長海、樂亭和乳山3個地區顯著性優勢菌群相對集中于變形菌門和擬桿菌門。營口地區仿刺參養殖池塘水體差異菌群則主要隸屬于放線菌門和浮霉菌門。其中，放線菌門以酸微菌(Ilumatobacter)、尤澤比氏菌(Euzebya)和腈基降解菌(Nitriliruptor)為代表。浮霉菌門以浮霉菌科為代表。

圖4 不同地區仿刺參養殖池塘水體菌群LEfSe分析Fig.4 LEfSe analysis of bacterial community in the water of sea cucumber culture ponds in different areas

2.5 環境因子監測

根據GB 3097—1997《中華人民共和國海水水質標準》，所監測的長海、營口、樂亭和乳山4個地區仿刺參養殖池塘夏季水體環境因子各項水質指標，均達國家海水二類水質標準。不同地區仿刺參養殖池塘水體pH 7.96～8.23，呈弱堿性；水溫23.88～26.23 ℃；鹽度27.30～28.60；溶解氧為7.19～8.22 mg/L。同時，水體理化指標呈現出顯著地域性差異。其中，營口地區仿刺參養殖池塘水體總磷、化學需氧量和有機碳含量顯著高于其他地區。

表2 水體環境因子監測Tab.2 Environmental factors in water samples

2.6 細菌群落影響因素

冗余分析(RDA)常用于解析細菌群落與其生境環境因子間的相互關系。門水平下，不同地區仿刺參養殖池塘水體菌群相對豐度與環境因子冗余分析結果見圖5。蒙特卡羅排序檢驗顯示，總有機碳、化學需氧量、磷酸鹽、總磷、溫度與水體菌群間存在顯著的相關性(P<0.05)，影響水體菌群的主導環境因子為總有機碳和化學需氧量，其次為磷酸鹽、總磷和溫度。其中，總有機碳、化學需氧量和磷酸鹽與營口仿刺參養殖池塘水體菌群相對豐度呈現出正相關性，與長海、樂亭和乳山水體菌群相對豐度呈現出負相關。氨氮和硝態氮與長海、樂亭和乳山水體菌群之間的影響作用呈正相關，與營口呈負相關。

圖5 菌群與環境因子RDA分析Fig.5 RDA analysis between bacterial communities and environmental factors

水體優勢菌群與主導環境因子間的相關性分析結果見表3。根據相關性系數的大小，確定各種菌群與環境因子的相關性水平。本試驗中，水體放線菌門與總磷含量呈極顯著正相關(P<0.01)，表明放線菌門受水中總磷影響較為顯著。浮霉菌門和Kiloniella與有機物含量呈極顯著正相關(P<0.01)，相關系數高于0.910，表明浮霉菌門和Kiloniella受有機物含量影響極顯著。玫瑰變色菌屬(Roseovarius)與總有機碳含量和化學需氧量呈極顯著負相關(P<0.01)，相關系數分別為-0.818、-0.801，表明玫瑰變色菌屬與總有機碳含量和化學需氧量具有極強的相關性。此外，變形菌門和擬桿菌門與主導環境因子間無顯著相關性。

表3 水體優勢菌群與主導環境因子相關性分析Tab.3 Correlation analysis between dominant bacterial communities and environmental factors in water

3 討 論

3.1 不同地區仿刺參養殖池塘水體菌群多樣性

微生物是池塘養殖生態系統的重要組成部分，其數量眾多且種類豐富，在物質循環和轉化過程中發揮著重要作用，對于維持養殖池塘生態系統微生態平衡及促進養殖生物健康生長具有重要的作用[14]。水體菌群物種豐度和多樣性受環境因子的共同調控[15-17]。其中，溫度是影響菌群多樣性和豐富度的重要因素[18-19]。已有研究表明，高溫通過加速細菌體內酶活性，控制其增殖代謝速率，使微生物迅速繁殖，多樣性增加[20]。此外，有機物含量與菌群多樣性具有顯著的相關性[21]，水體添加有機物質后，菌群多樣性明顯增加[22]。同時，有機物質的分解過程也加速了營養鹽的流動，為細菌生長創造適宜的條件，使菌群結構更加穩定[23]。營口地區仿刺參養殖池塘水體菌群多樣性顯著高于其他3個地區(P<0.05)，這主要是因為夏季營口地區仿刺參養殖池塘水體溫度和有機質含量相對較高，為微生物的繁殖棲息提供有利的條件，因此導致該地區水體菌群多樣性高于其他地區。

3.2 不同地區仿刺參養殖池塘水體菌群特征

本試驗中，不同地區仿刺參養殖池塘水體夏季優勢菌群均隸屬于變形菌門和擬桿菌門，二者相對豐度占比超過68.64%，與已報道的仿刺參養殖池塘水體優勢菌群相似[24-26]。其中，變形菌門作為第一優勢菌門(相對豐度占比高達51.10%以上)，主要是因為其在原核生物分子生物學分類或表型分類中占據了絕對的優勢[27]。而擬桿菌門作為次優勢菌門，是海洋浮游細菌的重要組成部分，其門下的黃桿菌綱和鞘脂桿菌綱與水中蛋白質代謝、氨基酸代謝及脂肪代謝等生物學過程有關，仿刺參養殖過程中產生的殘餌及糞便等有機質的分解，造成擬桿菌門含量增多，使其成為仿刺參養殖池塘水體次優勢菌門[28]。在屬水平上，不同地區仿刺參養殖池塘水體夏季優勢菌屬主要為玫瑰變色菌屬、遠洋桿菌屬、Kiloniella和棕囊藻桿菌屬。

種群遺傳學和群落生態學研究者發現，由于隨機分布或環境選擇，不同地區環境中均包含有一些獨特的細菌種群，環境微生物的分布存在顯著地域性差異[29]。本試驗結果顯示，不同地區仿刺參養殖池塘水體菌群結構存在顯著地域性差異(P<0.05)。其中，長海、樂亭和乳山仿刺參養殖池塘水體菌群相對豐度聚為一類，營口仿刺參養殖池塘水體菌群聚為一類。LEfSe分析表明，營口地區仿刺參養殖池塘水體差異菌門主要為放線菌門和浮霉菌門。微生物群落組成對環境差異有著較強的敏感性，菌群結構與其環境因素密切相關，不同形態營養元素含量、水體理化指標等因子的改變均會導致水體細菌群落結構及功能發生變化[30-34]。放線菌門與磷含量密切相關，水體中總磷含量的增加會促進放線菌的生長繁殖[35-36]。浮霉菌門主要為氨氧化細菌、厭氧氨氧化細菌和異養細菌，部分浮霉菌門微生物不僅能耐受高質量濃度有機碳，其代謝過程也高度依賴環境中有機物含量，相對豐度隨總有機碳質量濃度和化學需氧量升高而增加[37-43]。營口地區仿刺參養殖池塘水體差異菌門特征與其水中較高的磷和有機質含量呈現出一致性。

屬水平上，營口地區仿刺參養殖池塘水體菌群豐富度代表性菌屬為Kiloniella，其相對豐度與有機物(總有機碳和化學需氧量)呈極顯著正相關(P<0.01)。Kiloniella包含多種酶，如色氨酸脫氨酶、堿性磷酸酶、亮氨酸芳酰胺酶及胰蛋白酶等[29]，可以水解DNA，同時具有利用有機物中碳源的特性[44-45]。營口地區仿刺參養殖池塘水體中豐富的總有機碳和較高的化學需氧量，為Kiloniella的生長提供了有利條件，是其成為營口地區水體第一優勢菌屬的主要原因。此外，Kiloniella具有生物修復潛力，利用硝態氮或亞硝態氮作為末端電子受體進行反硝化作用，可以有效去除水中亞硝態氮污染物含量[46]。Kiloniella作為仿刺參養殖池塘水體中的優勢菌屬，可以在一定程度上為仿刺參健康生長提供優良的生態環境。此外，長海、樂亭和乳山地區仿刺參養殖池塘水體第一優勢菌屬為玫瑰變色菌屬，其相對豐度與有機物含量呈極顯著負相關(P<0.01)。玫瑰變色菌屬作為有氧產氧的光合細菌，在暗光、少碳限制條件下，其競爭能力超過化學趨化菌，成為最具代謝活性的細菌[47-49]。水體中有機物(總有機碳和化學需氧量)含量越低，玫瑰變色菌屬新陳代謝活性越強、競爭能力越大，相對豐度占比越高[50-51]。長海、樂亭和乳山地區水體中有機質含量較低，為玫瑰變色菌屬細菌的繁殖提供了有利的條件。由此可見，不同地區仿刺參養殖池塘差異菌群相對豐度特征與其主導環境因子地域性差異相吻合。

3.3 不同地區仿刺參養殖池塘水體差異菌群及其影響因素

微生物菌群特征是其生境環境因子的反映，與環境理化性質密切相關且相互限制影響[52]。蒙特卡羅排序檢驗和冗余分析結果顯示，不同地區仿刺參養殖池塘水體菌群與其生境環境因子之間存在顯著性相關，影響水體菌群的主導環境因子為總有機碳和化學需氧量，其次為磷酸鹽、總磷和溫度，且所有主導環境因子均呈現出顯著地域性差異。值得重視的是，主導環境因子總有機碳和化學需氧量均是反映水體環境有機物含量的評價指標。有機物不僅能為微生物提供碳源和能量，還能提供其生長繁殖所需的氮、磷、硫、鐵等營養元素，水中有機質含量能夠直接影響細菌的生物量和組成，進而對細菌群落結構的塑造起重要作用，是影響菌群結構變化的重要因素[53-54]。如擬桿菌門的某些細菌能夠利用N-乙?；?D-葡萄糖胺、浮游植物產生的高分子質量的溶解態有機碳[55]；交替單胞菌目細菌能夠利用N-乙酰基-D-葡萄糖胺，降解芳香族化合物，進行甲基營養代謝[56]；玫瑰桿菌(Roseobacter)類群可以利用二甲基巰丙酸內鹽、有機酸及浮游植物來源的碳水化合物[57]。另外，磷和溫度也可以通過促進或抑制菌群生長繁殖而對仿刺參養殖池塘水體菌群產生一定的影響[58]。

4 結 論

本試驗結果表明，不同地區仿刺參養殖池塘水體菌群呈現出顯著的地域性差異，化學需氧量和總有機碳是影響水體菌群結構的主導環境因子。因本試驗僅局限于夏季特定時間點，未能揭示仿刺參池塘養殖水體環境微生物群落的季節演替特征。后續需進一步針對不同季節不同地域開展大尺度的仿刺參養殖池塘生態系統微生物群落動態變化，以期為仿刺參養殖池塘管理提供精準的科學指導。