鱘源魯氏耶爾森菌多位點序列分型及耐藥譜測定

張小麗，麻強生，焦世璋，宋曉育，馬小軍

( 1.甘肅農業大學 動物醫學院，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅省永靖縣農牧局，甘肅 臨夏 731600； 3.河南省汝陽縣農業農村局，河南 洛陽 471200 )

我國自20世紀90年代開始鱘魚的商業化養殖，因其具有生長速度快、適應能力強、肉質鮮美和營養豐富等優點，有效地推動了我國淡水養殖業的進一步形成和發展，為養殖戶帶來了豐厚的經濟回報[1]。水產養殖業對保護和緩解漁業資源發揮了巨大作用，但是隨著人工養殖規模擴大和密度增加，逐漸產生了新問題，其中就包括細菌性疾病頻發。

魯氏耶爾森菌(Yersiniaruckeri)屬腸桿菌科、耶爾森菌屬，為革蘭氏陰性短桿菌。1966年Rucker[2]從患病虹鱒體內首次分離到魯氏耶爾森菌。魯氏耶爾森菌有生物1型和生物2型，生物1型運動力和水解吐溫80/20呈陽性，而生物2型呈陰性[3]。有報道表明，該菌主要感染淡水魚類，但近年來也出現大西洋鮭(Salmosalar)感染魯氏耶爾森菌的病例，并且逐年增加[4]。魚類感染魯氏耶爾森菌主要病變特征為泄殖孔紅腫、出血，體表及內臟器官充血、出血等。我國水產養殖中已有虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙魚(Aristichthysnobilis)、斑點叉尾(Ietaluruspunetaus)和鰻鱺(Anguillajaponica)等感染魯氏耶爾森菌的報道[5-8]。

2019年7—8月，甘肅省劉家峽某鱘魚養殖場由四川引進的雜交鱘(Acipenserschrenckii♀×A.baeri♂)出現采食量下降，精神沉郁，泄殖孔紅腫出血，少數魚吻部出血。發病時氣溫28 ℃、表層水溫25 ℃，體質量(160±20) g的雜交鱘日死亡率近10%，給養殖者帶來了巨大經濟損失。為探究雜交鱘發病原因，筆者采集病魚肝臟進行病原菌分離、鑒定、生物型檢測及多位點序列分型，并對其進行耐藥譜分析，為鱘魚細菌性疾病有效防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗用魚及主要試劑

患病雜交鱘60尾，體質量(160±20) g，同一時間采自甘肅省劉家峽某鱘魚養殖場。

大腸桿菌(Escherichiacoli)標準質控菌株ATCC25922為本實驗室保存；BHI瓊脂和BHI肉湯購自青島海博生物公司；細菌基因組提取試劑盒、2000 DNA Marker和PCR試劑購自諾唯贊(南京)公司；藥敏紙片購自廣東環凱微生物科技有限公司；基因擴增引物和序列測定由金唯志(天津)公司提供。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離

無菌條件下從60尾病魚肝臟取樣劃線接種于BHI平板，28 ℃恒溫培養48 h后挑取形態規格一致的單個優勢菌落在BHI平板上再次劃線培養，獲得純培養菌株后觀察菌落形態特征，-80 ℃保存備用。

1.2.2 病原菌鑒定

將純化的菌株接種BHI肉湯，28 ℃、220 r/min恒溫振蕩培養12 h后按照細菌基因組提取試劑盒說明書提取基因組DNA。以提取的基因組DNA為模板擴增16S rRNA，引物為：F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，R，5′-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3′；PCR反應體系為：25 μL mix，上下游引物各1 μL，1 μL模板DNA，ddH2O補足至50 μL；PCR循環為：94 ℃ 5 min，30×(94 ℃ 45 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s)，72 ℃ 7 min。擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至金唯智(天津)公司進行測序。

測序結果在數據庫上BLAST比對分析后，根據測定的16S rRNA序列與相關屬(種)16S rRNA序列利用MEGA 7.0軟件以鄰接法構建系統發育進化樹，各個分支的Bootstrap值選擇2000[9]。

1.2.3 生物型檢測

分離株穿刺接種半固體培養基，28 ℃恒溫培養24～48 h后觀察分離株生長狀況。僅沿穿刺線生長為陰性，表明無運動力；沿穿刺線生長且穿刺線兩側出現明顯的羽毛狀或云霧狀為陽性，表明有運動力[10]。分離株菌液用無菌生理鹽水適量稀釋后取0.2 mL均勻涂布于吐溫80水解培養基，28 ℃培養24～48 h后觀察菌落周圍是否出現渾濁，不出現渾濁為陰性，表明不水解吐溫80；出現渾濁為陽性，表明水解吐溫80[11]。因為大腸桿菌標準質控菌株ATCC25922有運動力且能夠水解吐溫80，所以接種在上述2種培養基與分離菌株同等環境和時間培養后作為對照組。

1.2.4 多位點序列分型

根據魯氏耶爾森菌MLST數據庫(https://pubmlst.org/yruckeri/)提供的6個管家基因和引物進行多位點序列分型。PCR反應體系為：25 μL mix，上下游引物各1 μL，1 μL模板DNA，ddH2O補足至50 μL；PCR循環參照魯氏耶爾森菌MLST數據庫進行(表1)。擴增結果經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至金唯智(天津)公司進行雙向測序。

測序結果用DNASTAR軟件進行拼接、質量驗證，登錄魯氏耶爾森菌MLST數據庫，對每株菌的6個管家基因序列進行查詢比對，得到相應的等位基因編碼，按照glnA、gyrB、dnaJ、thrA、hsp60和recA的排列順序，確定菌株的ST型。

表1 擴增魯氏耶爾森菌管家基因的引物和反應條件Tab.1 Primers and reaction conditions for amplification of the housekeeping genes of Y. ruckeri strain

1.2.5 系統發育分析

每株分離株的不同等位基因序列通過MEGA 7.0軟件Clustal W功能進行比對分析，串聯6個管家基因采用鄰接法進行Bootstrap值為2000次的重復構建系統發育樹。

1.2.6 耐藥譜測定

分離株接種于BHI瓊脂，選用強力霉素、卡那霉素、氟苯尼考、阿莫西林、大觀霉素、多黏菌素、恩諾沙星、諾氟沙星、氨芐西林和阿米卡星等10種藥敏紙片，參照美國臨床實驗室標準化委員會抗生素敏感試驗操作方法和判定標準進行紙片擴散法抑菌試驗[12]，總結歸納出耐藥譜。

2 結果與分析

2.1 病原菌分離鑒定

60尾患病雜交鱘泄殖孔均紅腫出血，部分病魚還出現吻部出血；剖檢后肝臟均有明顯出血點，部分病魚膽汁外溢，腎臟、心臟和脾臟無明顯變化(圖1)。60尾患病鱘魚肝臟中每尾都分離到1株優勢菌株，在BHI平板上形成邊緣整齊、表面光滑、透明的圓形菌落；16S rRNA序列與在美國國立生物技術信息中心網站BLAST中的魯氏耶爾森菌16S rRNA序列同源性達99%，且在系統發育樹中與魯氏耶爾森菌聚為一支(圖2)。所以，60尾患病鱘魚肝臟中分離到的病原菌是魯氏耶爾森菌，命名為LJX1～LJX60。

圖1 患病死亡雜交鱘外觀和病理剖檢Fig.1 Appearance and pathological examination of sick hybrid sturgeon A. schrenckii ♀ × A. baeri ♂a.外觀； b.吻部出血； c.泄殖孔紅腫出血； d.肝臟出血； e.膽汁外溢.a.the hybrid sturgeon appearance; b.bleeding in the snout of hybrid sturgeon; c.the cloacal swelling and redness of the hybrid sturgeon; d.bleeding liver in hybrid sturgeon; e.bile spill in hybrid sturgeon.

2.2 生物型檢測

60株魯氏耶爾森菌在半固體培養基僅沿穿刺線生長，說明無運動力；在吐溫80水解培養基未出現明顯的渾濁，說明不水解吐溫80。綜上所述，60株魯氏耶爾森菌分離株均為生物2型(圖3)。

2.3 多位點序列分型

6個管家基因glnA、gyrB、dnaJ、thrA、hsp60和recA經PCR擴增后電泳均獲得清晰單一條帶(圖4)。6個管家基因序列在魯氏耶爾森菌MLST數據庫中比對，得到相應等位基因編碼和ST型，共獲得6種ST型，未發現新的ST型(表2)；其中ST1有40株，ST2有8株，ST3有3株，ST5有2株，ST8有1株，ST13有6株(表3)。

圖2 60株魯氏耶爾森菌16S rRNA基因序列構建的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed from 16S rRNA gene sequences of 60 Y. ruckeri strains Group1是60株分離株，Group2是與分離株同源性高的菌株，Group3是耶爾森菌屬其他種. Group 1 is 60 isolates, Group 2 is a strain with high homology to the isolate, and Group 3 is other Yersinia species.

圖3 60株魯氏耶爾森菌的生物型檢測Fig.3 Biotype detection of 60 Y. ruckeri strainsa.穿刺試驗空白對照； b.魯氏耶爾森菌分離株穿刺試驗； c.大腸桿菌標準質控菌株ATCC25922穿刺試驗； d.水解吐溫80試驗空白對照； e.魯氏耶爾森菌分離株水解吐溫80試驗； f.大腸桿菌標準質控菌株ATCC25922水解吐溫80試驗.a.blank control in a puncture test; b.piercing test of Y. ruckeri strains; c.puncture test of E.coli standard quality control strain ATCC25922; d.blank control in a hydrolysis Tween 80 test; e.Y. ruckeri strains in hydrolyzed Tween 80 test; f. E.coli standard quality control strain ATCC25922 in a hydrolysis Tween 80 test.

圖4 6個管家基因電泳結果Fig.4 Electrophoresis of six housekeeping genes

表2 60株魯氏耶爾森菌ST型

(續表2)

表3 60株魯氏耶爾森菌MLST信息表Tab.3 MLST information on 60 strains of Y. ruckeri

2.4 系統發育分析

6個管家基因序列串聯后對60株魯氏耶爾森菌分離株進行系統發育樹分析，結果顯示，系統發育樹有2個明顯的分支Group1和Group2，在Group1中有ST3、ST5和ST8，而Group2中沒有這3種ST型，說明此次分離株在進化關系上有較大的差異；ST1、ST2和ST13魯氏耶爾森菌分離株在Group1和Group2均有，說明此次分離株即使是同一來源地的同一ST型，在進化關系上也有明顯的差異(圖5)。

圖5 60株魯氏耶爾森菌6個管家基因串聯系統發育樹Fig.5 A phylogenetic tree of six housekeeping genes of 60 strains of Y. ruckeri

2.5 耐藥譜測定

選用10種抗生素來測定60株魯氏耶爾森菌分離株的藥物敏感性，得到了9種耐藥譜(表4)。由表4可見，60株魯氏耶爾森菌分離株有19株對10種抗生素均敏感；耐1種抗生素的有18株，耐2種抗生素的有7株，耐3種抗生素的有8株，耐4種抗生素的有4株，耐5種抗生素的有4株。說明此次魯氏耶爾森菌分離株耐藥類型多樣，其中多重耐藥現象普遍，耐卡那霉素和恩諾沙星的比例最高，分別為43%和30%。結合耐藥譜和ST型發現，對10種抗生素都敏感的有6種ST型，即ST1、ST2、ST3、ST5、ST8和ST13；耐1種抗生素的有ST1、ST2和ST13；耐2種抗生素的有ST1、ST2和ST13；耐3種、4種和5種抗生素的有ST1。3種耐藥譜中有ST13，4種耐藥譜中有ST2，9種耐藥譜中全部都有ST1。綜上，本試驗結果顯示，此次60株魯氏耶爾森菌ST型可能與耐藥性無顯著相關性。

表4 60株魯氏耶爾森耐藥譜Tab.4 Drug resistance range of 60 strains of Y. ruckeri

3 討 論

3.1 我國鱘魚細菌性疾病研究

近年來我國鱘魚養殖規模不斷擴大，雖然給養殖者帶來可觀的經濟收入，但也逐漸出現了養殖密度增加和環境破壞等現象，隨之而來的是水質下降和細菌性疾病頻發。目前，我國報道鱘魚感染的細菌主要有停乳鏈球菌(Streptococcusdysgalactiae)、海豚鏈球菌(S.iniae)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)和魯氏耶爾森菌等[13-16]，細菌性疾病已經嚴重威脅到我國鱘魚的養殖。

3.2 生物型和ST型相關性分析

魯氏耶爾森菌目前有生物1型和2型，最近的研究顯示，生物1型的菌體長度大于生物2型，并且生物2型常暴發于接種過疫苗的魚類[3]。魯氏耶爾森菌出現2種生物型是由生物2型flhA或flhE基因缺失或flhA基因突變[17]所致。決定魯氏耶爾森菌ST型的6個管家基因不包括flhA和flhE基因，所以生物型與ST型沒有相關性。

3.3 相同ST型的進化關系分析

魯氏耶爾森菌MLST數據庫目前收錄了30種ST型，本試驗分離到6種ST型，占比為20%，說明此次鱘魚感染的魯氏耶爾森菌ST型較復雜。本試驗串聯6個管家基因系統發育樹表明此次魯氏耶爾森菌分離株即使是同一時間、同一來源地的相同ST型，在進化關系上也有明顯的差異，這可能是魯氏耶爾森菌在侵染宿主時或者在宿主體內隨著時間的推移，個別管家基因的某些位點發生了突變，導致同一ST型的不同個體出現差異。

3.4 耐藥性和ST型相關性分析

本研究選用10種抗生素對60株魯氏耶爾森菌進行藥敏性分析，共發現9種耐藥譜，其中耐卡那霉素和恩諾沙星的比例最高，分別為43%和30%。此次試驗結果顯示，魯氏耶爾森菌分離株的耐藥譜有所增加，楊昆明等[1]研究顯示，鱘源魯氏耶爾森菌對卡那霉素和恩諾沙星敏感，而本研究結果顯示，有36株魯氏耶爾森菌對卡那霉素和恩諾沙星明顯耐藥；方蘋等[6]研究顯示，鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙魚(Aristichthysnobilis)源魯氏耶爾森菌對恩諾沙星敏感，而本試驗結果顯示，有18株魯氏耶爾森菌對恩諾沙星明顯耐藥；本試驗中也有24株魯氏耶爾森菌分離株對卡那霉素和恩諾沙星敏感，這與楊昆明等[1,6]的研究結果相同。以上結果說明不同分離地區、不同水域、不同宿主和不同用藥情況均可導致魯氏耶爾森菌的耐藥性出現不同。

耐藥譜和ST型的相關性分析結果顯示，3種耐藥譜中有ST13，4種耐藥譜中有ST2，9種耐藥譜中均有ST1，即使是同一ST型的不同個體耐藥情況也不相同。因此筆者認為ST型可能和耐藥性之間沒有聯系，這可能是由同一ST型分離株的耐藥基因的某個位點發生突變或者是不同ST型分離株的耐藥基因相同所致。

3.5 臨床癥狀和病理變化與ST型相關性分析

本試驗中60尾患病雜交鱘除了出現共同的臨床癥狀(泄殖孔紅腫出血)和病理變化(肝臟出血)之外，其中5尾吻部出血，肝臟處分離到5株ST1型魯氏耶爾森菌，即菌株LJX1、LJX8、LJX32、LJX34和LJX38；3尾膽汁外溢，肝臟處分離到3株ST1型魯氏耶爾森菌，即菌株LJX21、LJX31和LJX36；1尾既出現吻部出血又出現膽汁外溢，肝臟處分離到1株ST1型魯氏耶爾森菌，即LJX60。所以，筆者認為，鱘魚感染同一ST型魯氏耶爾森菌可能會有不同的臨床癥狀和病理變化，感染不同ST型魯氏耶爾森菌可能出現相同的臨床癥狀和病理變化。這種現象的發生可能是同一ST型魯氏耶爾森菌的某些致病基因發生突變或者是不同ST型魯氏耶爾森菌的致病基因相同，還可能與鱘魚不同個體間的免疫系統出現差異有關。國內報道鱘魚感染魯氏耶爾森菌的主要癥狀為泄殖孔紅腫外突，偶見腹部、胸鰭部和嘴部出血；剖檢變化主要是肝臟出血甚至壞死，心臟、腎臟和脾臟等臟器的病變[1,16,18-19]；而本試驗結果表明，魯氏耶爾森菌還可導致鱘魚吻部出血和膽汁外溢。

3.6 國內外研究及防治策略分析

目前國內外魯氏耶爾森菌致病性的研究還不夠完善，大多是依賴基因組學和蛋白質組學方法來識別基于序列的毒力基因[20-22]。針對這種重要的經濟魚類病原菌，未來的研究應該通過試驗來解決毒力基因、耐藥性、耐藥基因、ST型、生物型和血清型相互之間的關系，這些都將是防治魚類魯氏耶爾森菌病的重要理論基礎。接種商品化疫苗已成為預防魚類魯氏耶爾森菌病暴發的重要途徑[23]；幾乎各國在治療魚類魯氏耶爾森氏菌病時都使用抗生素，雖然短期效果明顯，但是長期使用抗生素容易導致病原菌產生耐藥性，造成水體環境污染，引起食品安全等諸多問題。陶健等[24]發現，中草藥黃芩和訶子對鱘源魯氏耶爾森菌有明顯的抑菌作用，為魚類魯氏耶爾森菌病的防治提供了新方向。

4 結 論

本試驗中雜交鱘出現大批死亡是感染6種不同ST型(ST1、ST2、ST3、ST5、ST8和ST13)的生物2型魯氏耶爾森菌所致。