噬菌體防控水產品中細菌生物膜污染的研究進展

李 萌，馬永生，李 瑩，趙前程

( 1.大連海洋大學 食品科學與工程學院，遼寧 大連 116023; 2.遼寧省水產品分析檢驗及加工技術科技服務中心，遼寧 大連 116023; 3.大連工業大學，海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心，遼寧 大連 116034 )

我國2018年水產品總產量達到6.457 66×107t，水產品人均占有量達到46.28 kg[1]。隨著水產品消費量的提高，由細菌引發的水產品安全問題頻繁發生[2]。98%以上的細菌會黏附于有生命或無生命物體表面后，產生大量的多糖、脂類等多聚物基質包裹在自身菌體外，形成細菌生物膜保護細菌在惡劣條件下生存并轉移到新環境，加速細菌的交叉污染[3]。由于細菌生物膜結構的復雜性，在水產品加工過程中經清洗消毒工序仍難以有效清除，因此，控制水產品中細菌，特別是防控其形成的生物膜交叉污染食品，是控制水產品中食源性疾病發生的關鍵，也是保障食品安全的重要途徑之一。

噬菌體，作為一類生物抑菌劑，在自然界中分布廣泛，能夠專一性裂解宿主細菌，普遍認為對人體、動植物均無害[4]。目前國外已有針對食源性致病菌大腸桿菌(Escherichiacoli)、李斯特菌(Listeria)和沙門氏菌(Salmonella)的商品化噬菌體制劑[5-6]。同時，噬菌體編碼的內溶素和胞外多糖裂解酶也能有效清除特定的食源性細菌生物膜[7-8]。國內外針對食品工業中的細菌生物膜污染問題進行了深入研究，并針對噬菌體及其裂解酶對醫學領域的細菌生物被膜抑制效果進行了探討分析[9-12]。然而，仍缺少針對水產品中常見細菌生物膜的污染問題及相關噬菌體防控作用的研究分析，因此筆者針對噬菌體在水產品中細菌生物膜作用的研究進展進行了綜述。

1 水產品中細菌生物膜的形成及調控

不同種類的細菌、真菌、病毒和寄生蟲均會導致水產品食源性疾病，而由細菌污染和細菌毒素殘留引起的水產品食用安全問題占據較大比例。霍亂弧菌(Vibriocholerae)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、創傷弧菌(V.vulnficus)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、沙門氏菌和單增李斯特菌(L.monocytogenes)等為引起水產品污染幾率較多的食源性致病菌[13]。另外，水產品由于富含營養物質和水分，在貯藏過程中也容易受到腐敗微生物污染導致腐敗變質，希瓦氏菌屬(Shewanella)中的腐敗希瓦氏菌(S.putrefaciens)、波羅的海希瓦氏菌(S.baltica)以及假單胞菌屬(Pseudomonas)中的熒光假單胞菌(P.fluorescens)、惡臭假單胞菌(P.putida)等為有氧冷藏水產品中常見的優勢腐敗菌[14]。這些水產品中常見的致病菌和優勢腐敗菌均會在水產品、加工接觸面和水環境中形成生物膜(表1)。

1.1 常見食源性致病菌——弧菌屬

弧菌特別是霍亂弧菌、副溶血弧菌和創傷弧菌在世界范圍內是水產品，尤其是雙殼類軟體動物等濾食性動物中的常見致病菌，引起的水產品食源性疾病是許多國家面臨的公共衛生問題。

霍亂弧菌廣泛存在于河海口，產霍亂毒素的O1群和O139群菌株，會引起嚴重的腹瀉病從而引發霍亂的流行。霍亂弧菌能夠在浮游植物、浮游動物、貝類等水產品以及食品加工廠不銹鋼等接觸面生成生物膜[15]。霍亂弧菌群體感應系統(QS)通過抑制霍亂弧菌多糖(VPS)的生物合成對生物膜形成起到負調控作用，而3′,5′-環雙鳥苷酸(c-di-GMP)信號分子可通過促進霍亂弧菌多糖的生長，促進生物膜的形成[16]。另外，環磷腺苷—受體蛋白(cAMP-CRP)會抑制霍亂弧菌多糖的合成以及生物膜基質中蛋白質的合成，抑制生物膜的形成[17]。

表1 水產品中細菌生物膜形成情況Tab.1 Summary of research on biofilm of foodborne and spoilage bacteria from fishery products

副溶血弧菌在水產品流通過程中容易產生交叉污染，導致腸胃炎甚至引發敗血癥[40]。它能夠在硅藻形成的甲殼素，長牡蠣、大黃魚或其他來源的幾丁質表面形成生物膜[18-21]。副溶血弧菌生物膜的形成機制與霍亂弧菌一致，受群體感應系統和3′,5′-環雙鳥苷酸信號通路的調節。副溶血弧菌生物膜形成能力與細菌本身的細胞表面疏水性、自誘導因子(AI-2)生成量和蛋白酶活力呈正相關性[41]。Chung等[42]發現，編碼oxyR突變菌株生物膜生成量明顯低于野生菌株。黃倩等[43]研究表明，AphA蛋白能通過間接抑制scrABC和scrG基因的轉錄表達而促進3′,5′-環雙鳥苷酸的合成，進而促進副溶血弧菌生物膜形成。

創傷弧菌在世界范圍內的溫暖沿海水域和河口均有存在，且會污染蟹類、牡蠣、蝦類、蛤蜊和魚類等水產品[44-46]。Joseph等[22]的研究表明，創傷弧菌能夠在塑料、玻璃管和玻璃蓋玻片表面形成生物膜。創傷弧菌產生的莢膜多糖(CPS)、金屬蛋白酶(VVP)、脂多糖(LPS)和胞外多糖(EPS)等均與細菌的毒性作用密切相關，并對生物膜的生成具有一定的影響。有研究表明，莢膜多糖的表達會影響創傷弧菌在接觸物表面的吸附并抑制生物膜的形成[47]；創傷弧菌的2種群體感應系統——LuxS/AI-2和smcR基因均對金屬蛋白酶的表達具有調控作用[23-24]；Kim等[25]發現，創傷弧菌編碼的蛋白NtrC能夠通過調控脂多糖和胞外多糖的生物合成，進而調節生物膜的生成。Park等[26]對牡蠣表面的創傷弧菌生物膜形成能力進行了相關研究，結果發現，細菌胞外基質蛋白CabA能夠有效促進生物膜的形成。

1.2 常見食源性致病菌——沙門氏菌屬

沙門氏菌屬腸桿菌科細菌，致病能力強，會引起非傷寒沙門氏菌感染癥如急性腸胃炎，或是傷寒等烈性傳染病，是一種重要的食源性致病菌，在食品生產線的加工接觸面中均能檢測到其生物膜的存在，并引發多起水產品中毒事件[9]。沙門氏菌生物膜在不同的食品加工接觸面如不銹鋼、玻璃、鋁箔、聚乙烯和聚氟乙烯均存在不同程度的轉移率[31]。沙門氏菌生物膜能夠提高細菌對加熱、干燥、消毒劑和抗生素等外界環境的耐受能力，如Vestby等[32]對魚飼料廠和養殖廠分離的沙門氏菌生物膜形成能力的分析發現，在自然環境中耐受力越強的菌株，其形成生物膜的能力越強。沙門氏菌生物膜的調控機制非常精密復雜，生物膜生成受細胞間信號傳導系統中3′,5′-環雙鳥苷酸信號分子，群體感應系統，基因調控系統如CsgD因子、RpoS因子、Crl因子、外膜蛋白OmpR、IHF因子、H-NS蛋白、CpxR系統、MlrA調節因子、Csr系統、BarA/SirA以及PhoPQ-RstA雙組分系統等的影響[33]。

1.3 其他常見食源性致病菌

1.3.1 嗜水氣單胞菌

嗜水氣單胞菌屬氣單胞菌屬，為一種典型的人畜共患病原菌。在水產品批發市場未經加工的新鮮海鮮、蝦類或即食類水產品中，或在海水、淡水和污水環境中均檢測到嗜水氣單胞菌[48]。目前尚無嗜水氣單胞菌在水產品表面吸附形成生物膜的報告，但有研究表明，它能夠在不銹鋼、玻璃和生菜表面形成生物膜[27-29]。毛秀秀等[30]研究發現，致病性嗜水氣單胞菌能夠在聚苯乙烯酶標板表面形成生物膜，且Cyt c4和MshQ基因與該菌的成膜性相關；同時，Jahid等[49]的研究表明，嗜水氣單胞菌生物膜的形成受培養條件中葡萄糖濃度的調節。

1.3.2 單增李斯特菌

單增李斯特菌是一類常見的食源性致病菌，分布廣泛，在低溫條件下仍可生長繁殖，并已在淡水魚和蟹類等水產品原料以及熏魚，即食生鮮，蝦、貝類等水產加工產品中被檢出[50-51]。Takahashi等[52]研究表明，從即食水產品中分離的單增李斯特菌可形成生物膜。它可黏附在塑料和不銹鋼表面形成生物膜[34-35]。同時，常見的紫外線處理、干燥和消毒劑難以去除該類細菌的生物膜[53]。單增李斯特菌的生物膜與其致病性和耐藥性密切相關，影響其生物膜形成的關鍵因子有鞭毛糖蛋白，胞外DNA，胞外多糖，胞外結合蛋白和寡肽介導的Agr群體感應系統等[36]。

1.4 常見優勢腐敗菌

1.4.1 希瓦氏菌屬

希瓦氏菌能夠產生硫化物、胺類物質以及引起魚臭味的特征物質三甲胺，其中腐敗希瓦氏菌和波羅的海希瓦氏菌是海洋水產品中的優勢腐敗菌。腐敗希瓦氏菌對營養條件需求低，可在加工廠接觸面形成纖維狀生物膜，并由于代謝產生的硫化物和鐵離子可對不銹鋼接觸面造成微生物誘導的腐敗現象，致使食品交叉污染的機會增多[37]。劉娜娜[38]研究表明，波羅的海希瓦氏菌可在玻璃片上黏附形成生物膜，且形成能力受群體感應系統信號分子DPKs的影響。

1.4.2 假單胞菌屬

假單胞菌廣泛分布在土壤、水、食品加工廠環境中，會代謝產生大量醛、酮、酯和有異味的揮發性產物。假單胞菌屬在不同類型的介質表面均容易形成生物膜，且受群體感應系統和3′,5′-環雙鳥苷酸信號通路的調節影響[39]。假單胞菌屬中的熒光假單胞菌和惡臭假單胞菌為水產品中常見的優勢腐敗菌，不僅自身具有較強的生物膜生成能力，同時能夠顯著提高致病菌生物膜的定殖黏附能力[54]。

2 噬菌體防控水產品中細菌生物膜的應用

2.1 作用機制

噬菌體為細菌病毒，根據感染裂解細菌的方式被分為烈性和溶源性。烈性噬菌體的生長繁殖見圖1a。吸附和裂解為烈性噬菌體生長繁殖過程中的關鍵階段，保證噬菌體能夠將自身遺傳物質注入到宿主體內感染細菌，并在最后階段成功釋放出子代噬菌體。在這“一進一出”的過程中，細菌生物膜成為第一道屏障，部分噬菌體會編碼裂解胞外多糖的多糖降解酶，有效降解生物膜(圖1b)[55]。烈性噬菌體在裂解細菌后期編碼釋放的一類蛋白質，具有裂解細菌細胞壁，降解生物膜的作用，此類裂解酶又稱為內溶素(圖1c)。根據作用于細胞壁共價鍵位點的不同，噬菌體獨立進化出了至少4種不同內溶素，其中3類為水解酶，1類為糖基轉移酶[56]。因此，利用噬菌體及其編碼的裂解酶對細菌及其胞外多糖進行降解，達到消除或減少生物膜的目的。

圖1 烈性噬菌體及其編碼的主要裂解酶Fig.1 The lytic bacteriophage and phage-derived lyasea.烈性噬菌體生長繁殖過程； b.噬菌體吸附階段降解生物膜的多糖降解酶； c.噬菌體裂解階段降解革蘭氏陽性細菌細胞壁的內溶素.a.lytic life cycle of phages; b.polysaccharide depolymerase degrading the biofilm during the adsorption of the phage particle; c.structure of gram-positive bacteria cell wall and role of the endolysin during the bacteria lysis.

2.2 應用現狀

在食品加工過程中，交叉污染尤其是固體食品與食品加工接觸面之間的接觸污染(SFC)是食品工業中污染率最高的污染途徑[57]。因此，噬菌體及其裂解酶對水產品中細菌生物膜的抑制研究多以常見的食品加工接觸面材質為基礎。已有的研究表明，單一的噬菌體或噬菌體混合液對食品加工接觸表面上致病菌和腐敗菌形成的生物膜均有一定的消除或抑制生長效果(表2)。

在醫學領域，噬菌體編碼的裂解酶能夠有效地消除致病菌如豬鏈球菌(Streptococcussuis)、肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等形成的生物膜[73-75]。Oliveira等[63]研究發現，鼠傷寒沙門氏菌噬菌體編碼的內溶素Lys68對聚丙烯塑料表面生物膜中細菌的清除率可達99%。Cornelissen等[72]發現，惡臭假單胞菌噬菌體φ15編碼的尾部蛋白具有多糖裂解酶的活性，當φ15和尾部蛋白共同作用時對惡臭假單胞菌生物被膜的消除率約為37%，相同情況下單獨使用尾部蛋白無顯著消除生物膜效果。

表2 利用噬菌體及其裂解酶消除水產品中細菌生物膜的特性Tab.2 Application of bacteriophage and phage lyase in biofilm removal of bacteria in fishery product

2.3 應用尚需解決的問題

噬菌體的高度專一性以及細菌的多樣性和易產生抗性的特點，會導致噬菌體的抑菌性能降低[76]。水產品加工過程的清洗消毒工序諸如高溫、高壓、紫外線、pH、化學消毒劑等外界條件會對噬菌體制劑清除生物膜的效果產生影響。因此，商品化的噬菌體制劑多采用噬菌體混合液的方式，既解決單一噬菌體裂解譜較窄的問題，也降低目標菌株產生抗性的概率。開發可耐受外界環境的噬菌體或內溶素，如內溶素Lys68可在高溫條件下裂解沙門氏菌生物膜[63]。采用蔗糖等保護劑和微膠囊化技術對噬菌體進行有效保護，減緩加工過程中的嚴苛條件對其裂解性能的影響[77]。

噬菌體制劑的制備和安全檢測方法均較為成熟，可采用無致病性的菌株作為宿主菌，發酵擴增噬菌體，并通過離子交換和超濾膜過濾等技術去除溶液中的細菌碎片或其他雜質[78]。目前，已有去除噬菌體溶液中內毒素的成熟方法，并有商品化的試劑盒可用于檢測噬菌體溶液中的內毒素成分[79]。然而，噬菌體裂解酶多以重組表達的形式獲得，該類方法成本高，得率低，目前進行商品化的難度較大。同時仍需要對實際應用過程中的噬菌體或裂解酶進行風險評估，以確保其食用安全性。此外，國內尚未有針對噬菌體生物制劑生產使用相關的法規，消費者對此類產品的態度也并不容樂觀[80]。

3 展 望

食源性致病菌和腐敗菌在水產品加工接觸面，非加工接觸面(如下水道、墻壁等)以及牡蠣、蝦、蟹等水產品表面均可能生成生物膜，加劇水產品腐敗和細菌污染問題，且生物膜形成能力與細菌本身多方面如群體感應系統、信號分子、編碼的特殊蛋白和基因調控系統等密切相關。目前，國內外生物膜研究更偏向于致病菌，而對于腐敗菌相關研究仍較少。同時，在實際環境中，并非單一細菌獨立生成生物膜，而是多種細菌在水產品或加工環節中相互影響共同作用，后期應加強食源性混合菌種生物被膜的形成與種間相互作用研究。目前，已有商品化的噬菌體被應用到食品加工環節中有效抑制致病菌的生長繁殖，且針對細菌生物膜的防控研究具有一定的研究基礎。應用噬菌體及其裂解酶對水產品表面細菌生物膜的抑制應用仍然較少，并缺乏針對水產品或加工環境接觸面上的混合菌種生物膜的抑制作用研究。未來有待在闡明噬菌體及其裂解酶應用安全性的基礎上，建立規范的生產使用技術，逐步推廣其在水產品細菌防控中的應用。