過敏原檢測的臨床應用與新進展

李一仙，楊軍，夏宇

過敏是一個全球性問題，隨著現代工業化的進程，過敏性疾病的發生率顯著增高。過敏原是其發病的主要原因，而過敏原檢測是最重要的診斷依據。目前過敏原的檢測手段日益增多與完善，其對于不同年齡組、各類過敏性疾病等的適宜性不同，而臨床工作者對各種檢測方法的選擇往往存在困擾。另有原發性免疫缺陷病這類特殊患者，皮疹嚴重、IgE明顯升高，極易與過敏性疾病混淆。故總結歸納過敏原的各種檢測方法及其新進展，對查找過敏原并予以針對性防控，從而減少過敏性疾病的發作具有重要的臨床意義。

過敏性疾病的發病機制包括：IgE介導的Ⅰ型變態反應、其他3型變態反應和類過敏反應。其中IgE介導的Ⅰ型變態反應是最主要的機制。傳統的過敏原檢測主要分為兩大類，即體內檢測和體外檢測。體內檢測主要有：皮膚試驗(包括：皮膚點刺試驗、皮內試驗、特應性斑貼試驗)、口服食物激發試驗；體外檢測主要有IgE依賴的熒光酶標法、免疫印跡法、酶聯免疫吸附法等及非IgE依賴的嗜酸細胞陽離子蛋白檢測。IgE依賴的過敏原檢測是目前應用最廣泛的手段，其正往更快速、更微量血樣、更多檢測項目、更高靈敏度和精密度的方向發展，出現了生物芯片、分子診斷等手段；而非IgE依賴的過敏原檢測方法也因商業性的嗜堿性粒細胞活化試驗誕生，彌補了IgE依賴的過敏原檢測方法的不足，但技術尚未成熟。

1 體內檢測方法

1.1 皮膚試驗 皮膚試驗是診斷IgE介導的Ⅰ型變態反應的一線方法。其臨床價值在于通過皮膚對變應原的反應代替全身性過敏反應(鼻、肺、眼、腸道)，因為其簡單、直觀、成本低且安全性高，是目前應用最廣泛的方法[1]。

1.1.1 皮膚點刺試驗(skin prick test，SPT) SPT是通過特制的點刺針將皮膚淺層刺破，使特定的變應原滲入皮膚組織，IgE結合變應原后與真皮的肥大細胞膜FсεR1受體交聯，致敏肥大細胞脫顆粒，釋放組胺和其他炎性介質，引起皮膚局部毛細血管擴張和通透性增加，表現出風團和紅斑樣改變[1]。若與陰性對照(生理鹽水)比較，風團直徑>3 mm為陽性，若風團直徑<3 mm，同時組胺(陽性對照液)呈陽性，則認為結果為陰性[2]。

SPT被認為是可靠的過敏原檢測方法，其與血清特異性IgE的符合率達80%～90%。患者SPT陽性或者過敏原特異性IgE(specific IgE，sIgE)升高均證明對該過敏原敏感(即“敏化”)，但敏感患者需暴露后產生臨床癥狀才稱之“過敏”。湯建萍[3]研究表明，SPT陽性預報正確率<50%，而陰性預報正確率>95%，說明SPT陰性可基本排除該過敏原IgE介導的過敏，而SPT陽性還需激發試驗進一步確診。歐洲人群中，SPT對哮喘、過敏性鼻炎、特應性皮炎和食物過敏的臨床陽性預測值可達80%，而且風團越大，過敏的可能性越高[1]，但其大小與過敏的嚴重程度無相關性，SPT不能用于疾病的危險程度評估。SPT適用于Ⅰ型變態反應的疾病包括：過敏性哮喘、過敏性鼻炎、過敏性結膜炎、食物過敏、青霉素/毒液/乳膠過敏，且任何年齡的患者均可，但不同年齡的反應性有差異，如嬰兒的陽性反應較小。近1個月有全身性過敏反應(可使皮膚暫時無反應)及一些藥物會造成假陰性結果，故試驗前應停用抗組胺藥物4～5 d，且3周內避免在進行皮膚測試的地方使用皮質類固醇[1]。因過敏原直接作用于人體，有發生過敏性休克的風險，哮喘急性期、強烈的過敏發作期以及不配合的兒童不適合做點刺試驗[3]。另外，SPT的結果判斷受技術和所用試劑的影響[2]，其傳統的致敏劑是天然過敏原提取物，目前已有重組或高純度的致敏蛋白標準品應用于臨床[4]。

1.1.2 皮內試驗 皮內試驗是將比SPT更低濃度和劑量的過敏原提取物注射至皮內，15～20 min后讀取結果。既可用于評價IgE介導的速發性變態反應，也可用于評價遲發型變態反應。主要適用于疑似呼吸道過敏但SPT陰性、毒液和藥物過敏的病例[1]。皮內試驗的禁忌證與SPT無異，為安全起見，皮內試驗前必須先行SPT，與SPT相比，其具有更高的敏感性和更低的特異性[1]，但其發生不良反應的風險更大也更嚴重。

1.1.3 特應性斑貼試驗(atopy patch test，APT) APT是通過患者的皮膚長時間(通常為48 h)暴露于接觸性變應原，誘發細胞介導的遲發型變態反應[1]，常在第72小時解讀反應結果，是診斷過敏性接觸性皮炎的金標準[5]，但近期才被用于評估食物過敏。因其安全性高，兒童也推薦使用[6]。此法適用于懷疑潛在或繼發性過敏性接觸性皮炎的患者[6]；或SPT和sIgE均陰性但懷疑有過敏反應者；或多種sIgE(+)，但無法證實與臨床關聯的特應性皮炎患者[3]；或食物過敏中懷疑為遲發型反應者[7]。對于牛奶和雞蛋過敏，APT聯合sIgE檢測的陽性預期值達到94%以上，無需食物激發試驗再進一步確診[8]。

該方法中，接受全身皮質類固醇、環孢素或霉酚酸酯等免疫抑制劑治療者可能出現假陰性結果，但抗組胺藥物對結果無干擾[5]。對APT部位進行局部皮質類固醇、局部鈣調神經磷酸酶抑制劑或紫外線照射可抑制斑貼試驗反應，故APT前5～7 d內不應涂抹皮質類固醇或鈣調神經磷酸酶抑制劑，APT前2～4周不要曬黑或日光浴[5]。APT目前在國際上已有4 000多種變應原，對特應性皮炎的診斷有重要意義。但APT易受抗原濃度過低、受試者皮膚反應性下降、方法學的錯誤等影響，據估計，其假陰性結果高達30%[5]，對特應性皮炎檢測的陽性率低于SPT和體外實驗，但其與臨床病史有顯著相關性，特異性更好。

1.2 口服食物激發試驗 口服食物激發試驗是診斷食物過敏的金標準[9]，由于皮膚試驗和過敏原sIgE檢測不能將“敏化”與“過敏”區分開，常需口服食物激發試驗來證實或排除食物過敏或其是否消退。本試驗需在醫院內進行，需準備好急救藥物和設備；食物過敏原一般從10 mg開始給予，如未出現有關過敏癥狀，則每隔15～60 min將劑量加倍，直到增至8～10 g。若試驗過程中出現速發性過敏反應，或特應性皮炎積分指數增加10分以上為陽性；若無癥狀出現，則可排除該食物過敏[3]。該試驗風險較大，可能導致嚴重的過敏反應；檢測時間較長、昂貴、費力、需要專門的環境，而且激發試驗的方案一直無法完全標準化，臨床應用較少。

2 體外檢測方法

2.1 血清總IgE和sIgE IgE檢測是評估可疑過敏反應的基本方法[1]，較體內檢測方法更安全、簡單、不受抗組胺藥物影響，具有重復性強、精確性高和可定量等優點，但不同試劑和生產商之間的結果存在較大差異[10]。對于兒童患者，不同年齡的血清IgE水平有明顯差異，臍帶血IgE水平很低(<0.5 IU/mL)，出生后隨年齡增長而逐漸升高，12歲時達成人水平(20～200 IU/mL)，一般認為>333 IU/mL時為異常升高。但總IgE只是對過敏性疾病的粗略判斷，總IgE增高也可見于除過敏外的其他疾病：如寄生蟲感染、支氣管肺曲霉菌病、部分吸煙者、多發性骨髓瘤、某些原發性免疫缺陷(X連鎖免疫失調內分泌腸病綜合征、Omenn綜合征、Wiskott-Aldrich綜合征、Comel-Netherton綜合征和高IgE綜合征)等[11]。反之，總IgE正?；驕p少并不能排除過敏[1]。一些樣本量較大或研究人群同質性更強的研究發現，發生特異性IgE濃度更高的患者發生重度反應的風險更大[12]，但靶器官敏感性差異、患者的一般健康狀態、變應原攝入量等相關因素影響，其實血清sIgE濃度不能可靠地預測反應的嚴重程度。

2.1.1 sIgE的單一檢測分析 sIgE的檢測主要通過免疫方法，包括免疫熒光法、免疫印跡法、酶聯免疫吸附法、熒光酶免疫分析、化學發光分析或放射過敏吸附分析等[13]。免疫熒光法檢測總IgE和sIgE是國際上體外過敏原診斷的金標準[3]。國內IgE檢測主要是免疫熒光法(phadia)、免疫印跡法(敏篩、歐蒙、浙大迪訊等)和酶聯免疫吸附法(浩歐博、浙大迪訊等)，三者在過敏原檢測種類、用血量方面均明顯提升。目前國內唯一提供定量檢測的方法是免疫熒光法，其過敏原檢測種類在2019年已更新至31種，用血量40 μL血清/種，但其價格偏高。免疫印跡法，一般為成套檢測，分食物過敏套餐、吸入過敏套餐和食物吸入套餐等，組合項目有29項，包含過敏原60種，用血量300 μL血清/項，因其通量大，價格適中，用血量少，具有極高的特異性和敏感度，在國內使用最廣泛。酶聯免疫吸附法檢測sIgE較免疫印跡法價格貴、檢測項目偏少，共有18個組合項目，用血量200 μL血清/項，但其可于體外定量檢測血清特異性IgG濃度，臨床上更常用于輔助診斷IgG介導的食物不耐受。

2.1.2 sIgE的多重分析 變應原微陣列，近年來已在國外廣泛應用，國內也已引進相應設備和試劑，其優點是省時、高效、精準、高通量平行檢測、結果可靠[3],但可導致臨床的過度診斷[14]。已應用于臨床的是免疫固相變應原芯片系統，其包含112種過敏原。還在開發的有歐洲的MeDALL芯片(含170種過敏原)、澳大利亞的Alex(含有282種試劑，包含157種過敏原提取物和125種重組或高度純化的致敏蛋白)。變應原微陣列還可評估除血清或血漿外的液體中特異性IgE的情況[1]。如免疫固相變應原芯片在春季角結膜炎患者淚液中檢測到食物過敏原sIgE，甚至有些是血清中沒有的sIgE[15]。另外，Schmid等[16]觀察到治療前過敏原sIgE可能控制IgG4的誘導，而在增加皮下免疫治療劑量后，免疫固相變應原芯片測得sIgE水平明顯降低，IgG4水平升高，提示可通過sIgE水平評估免疫治療療效。免疫固相變應原芯片由于能同時檢測sIgE和過敏原特異性IgG4[17]，而被認為也是過敏原免疫治療的療效監測手段。

2.1.3 (變應原)組分解析診斷 也稱“分子變應原”診斷法，與傳統sIgE檢測方法不同，其變應原是通過液相色譜/質譜等技術純化天然過敏原[18]或通過重組技術獲得的單一蛋白或多肽組分[19]，而非提取物整體，避免一些同源蛋白的交叉反應導致檢測結果呈陽性，但不具有臨床意義，卻造成食物過敏的過度診斷。組分解析診斷有助于提高檢測的特異性，建立個體的初級和交叉反應致敏譜[20]，定制更詳細的不同過敏原的風險評估，幫助制定飲食建議，減少患者不必要的飲食回避。但目前只有吸入性變應原和1種食物(榛子)變應原應用于市場，組分解析診斷的大多數變應原仍處于實驗研究階段[18]。

2.2 嗜堿性粒細胞活化試驗(basophil activation test，BAT) 嗜堿性粒細胞是可從外周血中獲取的特異性致敏效應細胞，是研究sIgE/FcεRI依賴的脫顆粒作用的良好對象[1]。最常見的BAT是直接用抗原激活嗜堿性粒細胞，采用流式細胞儀檢測嗜堿性粒細胞上特定表面抗原如CD63、CD203c的表達，或測定其活化后脫顆粒產生的活性物質(主要是組胺)[21]。但約10%的細胞捐贈人群有“無能”嗜堿性細胞，即BAT中的無反應者[22]。為識別這些無反應者，需抗IgE或抗-FcεRI作為BAT的陽性對照[23]，而試驗結果評估的最佳指標是CD63+/抗-FcεRI比值[24]或曲線下面積[25]。

BAT可用于評價IgE介導及非IgE介導的(類)過敏反應[26]，診斷各種吸入性過敏原(花粉、屋塵螨和貓屑)、食物(包括與花粉有關的食物過敏)、天然膠乳、昆蟲毒液、某些藥物(主要是箭毒和β-內酰胺類抗生素)引起的過敏性疾病及有抗FcεRI或抗IgE自身抗體的慢性蕁麻疹[19,23]，甚至可作為脫敏治療的療效指標[23]。因為嗜堿性粒細胞活化是一種生物學反應，且不受抗組胺藥物影響，BAT陽性可說明臨床過敏，診斷的準確性高于皮膚試驗及sIgE檢測[27]，安全性高于激發試驗及斑貼試驗。BAT可識別不同嚴重程度的過敏表型，如牛奶過敏更持久且更嚴重者的嗜堿性粒細胞在體內對牛奶的反應更強[28]；BAT可區分牛奶過敏兒童中哪些仍存在過敏，哪些過敏反應已隨年齡增長消失但仍存在敏化[29]。但BAT檢測技術難度大，雖然已有商業化檢測試劑盒問世，但對其結果的界定和解釋尚無統一標準，尚需繼續的研究和開發[1]。

2.3 嗜酸性粒細胞和嗜酸性粒細胞陽離子蛋白(eosinophil cationic protein，ECP) 活化的嗜酸性粒細胞是遲發相Ⅰ型變態反應的主要細胞，ECP是其釋放的最具細胞毒性的生物活性蛋白[3]，過敏患者的ECP水平在予抗過敏藥物或特應性免疫治療時會明顯下降[30]。雖然ECP水平易受性別、種族、吸煙習慣、寄生蟲和藥物等混雜因素的影響[30]，不適用于過敏原的篩查，但ECP可作為過敏性疾病病情活動與治療療效的指標[3]。酶聯免疫吸附法常用于測定血液、痰液等標本中的ECP水平，其成本低、簡便、快捷、不需特殊儀器。

過敏原檢測方法在臨床應用時需考慮以下三點:患者個體情況、懷疑的發病機制(IgE或非IgE介導)及各種檢測方法的優勢與局限性，選出最合適的檢測手段。無論用哪種過敏原檢測方法，都需要結合病史和體格檢查來診斷。為了確定食物過敏的嚴重程度、區分敏化與臨床過敏和評估療效，更好地診治過敏性疾病，還需改進現有檢測方法或開發新的方法。