復(fù)方獨(dú)活益腎合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究

李德林，任路路，韓 雙

（安徽省太和縣中醫(yī)院中藥制劑室，安徽 阜陽(yáng) 236600）

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腰肌勞損多屬“痹癥”范疇，多因久痹而致肝腎兩虛，氣血不足而發(fā)。臨床研究表明，中醫(yī)藥治療慢性腰肌勞損不僅療效顯著，作用持久，且不易復(fù)發(fā)［1］。復(fù)方獨(dú)活益腎合劑系我院名老中醫(yī)根據(jù)中醫(yī)學(xué)理論，結(jié)合臨床實(shí)踐研制而成的院內(nèi)制劑，由獨(dú)活、白芍、秦艽、桂枝、防風(fēng)等15 味中藥組方，具有補(bǔ)肝腎、益氣養(yǎng)血、祛風(fēng)止痛功效，主要用于治療腰肌勞損、腰膝冷痛及肢節(jié)屈伸不利，臨床療效較好。現(xiàn)行復(fù)方獨(dú)活益腎合劑執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)較簡(jiǎn)單，僅采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定蛇床子素的含量，而蛇床子素水提取工藝條件下轉(zhuǎn)移率較低，在實(shí)際控制該制劑質(zhì)量時(shí)存在一定缺陷。此外，單一成分含量測(cè)定已很難保證復(fù)雜成方制劑的質(zhì)量，多組分含量測(cè)定更能體現(xiàn)成方制劑的內(nèi)在質(zhì)量［2］。為進(jìn)一步控制復(fù)方獨(dú)活益腎合劑的質(zhì)量，保證臨床療效，本研究中建立了獨(dú)活、白芍、秦艽的薄層色譜（TLC）法，芍藥苷含量測(cè)定的HPLC 法。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器及試藥

1.1 儀器

XSE105DU 型電子天平（瑞士梅特勒－托利多公司，精度為十萬(wàn)分之一）；Ultimate 3000 型高效液相色譜儀（配備紫外檢測(cè)器，美國(guó)賽默飛世爾公司）；ZF－2 型三用紫外儀（上海市安亭電子儀器廠）；DHG－9055A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；HH－S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)宇儀器制造有限公司）；KQ－300DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為300 W，頻率為40 kHz）；硅膠G 板（青島海洋化工廠分廠）；硅膠G254板（煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所）。

1.2 試藥

秦艽對(duì)照藥材（批號(hào)為121199－201003），獨(dú)活對(duì)照藥材（批號(hào)為120940－201612），芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)為110736－201943，純度為95.10%），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；復(fù)方獨(dú)活益腎合劑（規(guī)格為每瓶250 mL，本院中藥制劑室自制，批號(hào)分別為20052301，20052501，20052701）；獨(dú)活、白芍、秦艽、桂枝、防風(fēng)等15 味中藥飲片均購(gòu)于安徽金正元中藥飲片有限公司；乙腈為色譜純，水為純化水，甲醇、乙醚、正丁醇等其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

獨(dú)活：分別取3 批（批號(hào)分別為20052301，20052501，20052701）樣品，各20 mL，加無(wú)水乙醚振搖提取2 次，每次20 mL，合并乙醚液，保留水液層備用，揮干乙醚液，殘?jiān)右掖? mL 使溶解，作為供試品溶液；另取獨(dú)活對(duì)照藥材2 g，加乙醇10 mL，水浴加熱，回流提取2 h，放冷，濾過(guò)，濾液濃縮至1 mL，作為對(duì)照藥材溶液；再按復(fù)方獨(dú)活益腎合劑制備工藝制備不含獨(dú)活的陰性樣品，同法制得缺獨(dú)活的陰性對(duì)照品溶液。照2015 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502 試驗(yàn)，吸取上述3 種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（30 ～60 ℃）－乙醚－醋酸（10 ∶10 ∶0.5，V／ V／ V）為展開(kāi)劑［3－4］，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與獨(dú)活對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰，分離效果較好，陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖1 A。

白芍：取獨(dú)活項(xiàng)下乙醚提取后的水溶液，置已處理好的聚酰胺層析柱（規(guī)格為5 g，內(nèi)徑為1.5 cm）上，水液沖至無(wú)色，收集洗脫液，水浴濃縮至30 mL，用水飽和的正丁醇提取2 次，每次30 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)右掖? mL 使溶解，作為供試品溶液；另取芍藥苷對(duì)照品，加乙醇制成每1 mL 含2 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液；再按復(fù)方獨(dú)活益腎合劑制備工藝制備不含白芍的陰性樣品，同法制得缺白芍的陰性對(duì)照品溶液。照2015 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502 試驗(yàn)，吸取上述3 種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－甲酸（40 ∶5 ∶10 ∶0.2，V／ V／ V／ V）為展開(kāi)劑［5－6］，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與芍藥苷對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰，分離效果較好，陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖1 B。

秦艽：分別取3 批（批號(hào)分別為20052301，20052501，20052701）樣品，各30 mL，加無(wú)水乙醇70 mL，靜置，過(guò)夜，離心，取上清液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液；另取秦艽對(duì)照藥材0.5 g，加甲醇50 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?0 mL 使溶解，作為對(duì)照藥材溶液；再按復(fù)方獨(dú)活益腎合劑制備工藝制備不含秦艽的陰性樣品，同法制得缺秦艽的陰性對(duì)照品溶液。照2015 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502 試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G254薄層板上，以乙酸乙酯－甲醇－水（20 ∶2 ∶1，V／ V／ V）為展開(kāi)劑［7－9］，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與秦艽對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖1 C。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件［10－12］與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

圖1 薄層色譜圖Fig.1 TLC chromatograms

圖2 高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms

色譜柱：Welch ZapchromTMC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）－0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0 ～16 min 時(shí)15%A，16 ～25 min 時(shí)15%A ～70%A，25 ～35 min 時(shí)70%A ～15%A）；流速：1.0 mL／min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；進(jìn)樣量：5 μL。理論板數(shù)按蛇床子素峰計(jì)應(yīng)不低于2 000。

2.2.2 溶液制備

量取芍藥苷對(duì)照品18.98 mg，精密稱(chēng)定，置50 mL容量瓶中，加入適量甲醇溶解，并定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.361 0 mg／mL 的對(duì)照品貯備液。再精密量取上述對(duì)照品貯備液1 mL，置10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.036 1 mg／mL 的對(duì)照品溶液。精密量取樣品2 mL，置20 mL 容量瓶中，加稀乙醇15 mL，超聲處理（功率為300 W，頻率為40 kHz）20 min，放冷，再加入稀乙醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取缺白芍藥材的陰性樣品，依法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性試驗(yàn)：按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件，分別吸取2.2.2 項(xiàng)下供試品溶液、芍藥苷對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照品溶液各5 μL，進(jìn)樣測(cè)定。色譜圖見(jiàn)圖2。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相同保留時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)芍藥苷色譜峰，且芍藥苷分離度及拖尾因子均符合要求，陰性對(duì)照無(wú)干擾，表明專(zhuān)屬性良好。

線性關(guān)系考察：分別吸取2.2.2 項(xiàng)下芍藥苷對(duì)照品溶液1，2，5，8，10，15 μL，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以芍藥苷對(duì)照品進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y ＝0.021 6 X ＋0.092，r ＝0.999 9（n ＝6）。結(jié)果表明，芍藥苷進(jìn)樣量在36.10 ～541.50 μg 范圍與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取2.2.2 項(xiàng)下芍藥苷對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為0.036 1 mg／mL）適量，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果芍藥苷平均峰面積為4.072 7，RSD 為0.25%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20052501）樣品，依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果芍藥苷平均峰面積為4.075 8，RSD 為0.22%（n ＝6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)較穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密量取同一批（批號(hào)為20052501）樣品，共6 份，按2.2.2 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，再按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果芍藥苷平均峰面積為4.115 3，RSD 為0.77%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取已知含量的樣品（批號(hào)為20052501）6 份，每份1 mL，置20 mL 容量瓶中，分別加入芍藥苷對(duì)照品貯備液（質(zhì)量濃度為0.361 0 mg／mL）各1 mL，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n ＝6）Tab.1 Results of the recovery test（n ＝6）

2.2.4 樣品含量測(cè)定及含量限度確定

通過(guò)測(cè)定投料前處方中白芍飲片及3 批（批號(hào)分別為20052301，20052501，20052701）樣品中芍藥苷的含量，計(jì)算芍藥苷的轉(zhuǎn)移率。結(jié)果樣品中芍藥苷的含量分別為0.369 2，0.3725，0.3758mg／mL，平均含量為0.3725mg／mL。生產(chǎn)原料白芍中芍藥苷的含量為3.0 %。因處方中每1 mL含白芍生藥0.04 g，相當(dāng)于每1 mL 含芍藥苷1.2 mg，平均轉(zhuǎn)移率為31.04 %。根據(jù)2015 年版《中國(guó)藥典（一部）》規(guī)定，白芍飲片中芍藥苷的含量不得少于1.20%。制成制劑后相當(dāng)于每1 mL 不得少于0.47 mg，結(jié)合芍藥苷的平均轉(zhuǎn)移率，應(yīng)不少于0.145 9 mg，再結(jié)合多批制劑含量測(cè)定結(jié)果及工業(yè)化大生產(chǎn)，故暫定該制劑每1 mL 含芍藥苷不得低于0.20 mg。

3 討論

原標(biāo)準(zhǔn)獨(dú)活TLC 項(xiàng)下，供試品的處理采用樣品蒸干加適量乙醇超聲提取，顯色時(shí)噴以8%磷鉬酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，主斑點(diǎn)分離雖好，但背景顏色較深，且操作較復(fù)雜，尤其蒸干較耗時(shí)。參考相關(guān)文獻(xiàn)，本研究中根據(jù)獨(dú)活所含化學(xué)成分的理化性質(zhì)，采用乙醚提取，置紫外光燈下檢視，結(jié)果顯色效果較好，且操作簡(jiǎn)單，而乙醚提取后的水液層又可繼續(xù)為白芍TLC 鑒別所用。

原標(biāo)準(zhǔn)白芍TLC 項(xiàng)下，供試品的處理以水飽和的正丁醇萃取，但在實(shí)際顯色中，供試品中芍藥苷分離效果不太理想，在芍藥苷斑點(diǎn)處有其他成分覆蓋，故首先對(duì)展開(kāi)劑進(jìn)行了優(yōu)化，但改變甚微，考慮到供試品所含成分復(fù)雜的可能性，在原處理過(guò)程中增加了聚酰胺層析純化步驟。結(jié)果顯示，供試品中芍藥苷在原展開(kāi)劑條件下，分離效果較好。

對(duì)秦艽進(jìn)行TLC 鑒別時(shí)，比較了2 種顯色系統(tǒng)，一種是硅膠G 板，以乙酸丁酯－甲醇－水（20 ∶2 ∶1，V／ V／ V）為展開(kāi)劑，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰；另一種為硅膠G254板，以乙酸乙酯－甲醇－水（20 ∶2 ∶1，V／ V／ V）為展開(kāi)劑，置紫外光燈下檢視。結(jié)果顯示，在使用G254板置紫外光下檢視時(shí)，主斑點(diǎn)清晰，且操作更簡(jiǎn)便。

此外，本研究中還對(duì)方中防風(fēng)、桂枝、熟地黃、桑寄生、茯苓等藥味進(jìn)行了TLC 鑒別。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，防風(fēng)、桂枝、熟地黃及茯苓陰性對(duì)照有干擾，桑寄生、杜仲及其他藥物主斑點(diǎn)不清晰，有待后續(xù)進(jìn)一步研究，故暫未納入復(fù)方獨(dú)活益腎合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

考察了不同提取溶劑甲醇、50%甲醇和稀乙醇超聲提取對(duì)芍藥苷含量測(cè)定的影響［12－14］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品加入甲醇后呈混懸狀態(tài)，吸附嚴(yán)重，提取效果較差；50%甲醇和稀乙醇比較發(fā)現(xiàn)，稀乙醇提取率較高。考察了不同超聲時(shí)間（10，20，30 min）對(duì)芍藥苷含量測(cè)定的影響。結(jié)果顯示，稀乙醇超聲20 min 的芍藥苷含量較超聲10 min 高，而與超聲30 min 相差不大，表明超聲20 min 可提取完全。故選擇稀乙醇超聲20 min 為最佳提取方法。考察了不同流動(dòng)相（乙腈－水和甲醇－水）對(duì)芍藥苷含量測(cè)定的影響［11－12］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有機(jī)相為乙腈時(shí)，芍藥苷理論板數(shù)較甲醇系統(tǒng)高，且出峰時(shí)間較短；無(wú)機(jī)相為磷酸水溶液時(shí)，芍藥苷色譜峰形對(duì)稱(chēng)性及分離度更好。考察了不同品牌色譜柱（Hypersil ODS2 柱，Wonda Cract ODS2 柱及Welch ZapchromTMC18柱）對(duì)芍藥苷含量測(cè)定的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Hypersil ODS2 柱上芍藥苷分離度較差，Welch ZapchromTMC18柱較Wonda Cract ODS2 柱出峰時(shí)間短，且分離效果更佳。故選擇以乙腈－0.1%磷酸溶液和Welch ZapchromTMC18柱作為最佳流動(dòng)相和色譜柱。

綜上所述，本研究中建立的獨(dú)活、白芍及秦艽的TLC 法陰性對(duì)照無(wú)干擾，斑點(diǎn)清晰，且專(zhuān)屬性較強(qiáng)；芍藥苷的HPLC 含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便易行，重復(fù)性較好，可用于提升復(fù)方獨(dú)活益腎合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。