肝癌組織miR-146b-5p和miR-134的表達(dá)下調(diào)及臨床意義*

王珣 曾會(huì) 陳志娟 刁卓 司毅

(漢中市中心醫(yī)院，陜西 漢中 723000)

肝癌是一種以肝區(qū)疼痛、消化道癥狀、黃疸和腹水等為臨床癥狀的肝臟惡性腫瘤，具有侵襲力強(qiáng)、死亡率高的特點(diǎn)，其發(fā)病率逐年上升，已成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的第五大惡性腫瘤[1]。由于肝癌發(fā)病早期無(wú)典型癥狀，當(dāng)患者不適就醫(yī)時(shí)，多已處于肝癌中晚期，給肝癌的治療及預(yù)后帶來(lái)不良影響[2]。因此，對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程進(jìn)行深入研究，對(duì)于肝癌的診斷、治療具有重要意義[3]。研究認(rèn)為，肝癌的發(fā)生可能與基因調(diào)節(jié)細(xì)胞進(jìn)程的失調(diào)有關(guān)，而微小RNAs(miRNAs)的異常表達(dá)在這一過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用[4]。miR-146b-5p是一種小分子單鏈RNA，被認(rèn)為參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[5]；miR-134在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲能力方面效果顯著[6]。目前，有關(guān)miR-146b-5p和miR-134在肝癌組織中的表達(dá)情況的報(bào)道較少，本研究分析miR-146b-5p和miR-134的在肝癌組織中的表達(dá)水平，探討其與肝癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系，以期為肝癌的臨床診斷、治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年6月～2018年12月我院收治的原發(fā)性肝癌患者73例，取患者的原發(fā)腫瘤組織為觀察組，同時(shí)選取相對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織標(biāo)本(距離腫瘤組織邊緣>5 cm)為對(duì)照組，均制作成3 μm切片標(biāo)本。由專(zhuān)業(yè)病理科醫(yī)師于術(shù)中直接獲取新鮮的腫瘤組織和癌旁正常組織，腫瘤組織所取體積視病灶大小而定，盡量不要沾染到癌旁良性組織；癌旁正常組織于距離腫瘤組織邊緣>5 cm處取得，所取大小約為1 cm×1 cm×0.6 cm，分離過(guò)程中盡量不要沾染到病灶區(qū)域。取樣后立即放入液氮保存，4%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床檢查符合原發(fā)性肝癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]：有明確的慢性肝病史；經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診為原發(fā)性肝癌；CT或MRI影像學(xué)檢查顯示肝臟占位在動(dòng)脈期快速不均質(zhì)血管強(qiáng)化，而靜脈期或延遲期快速洗脫；血清甲胎蛋白(AFP)≥400 μg/L，持續(xù)時(shí)間≥30 d，或AFP≥200 μg/L，持續(xù)時(shí)間≥60 d，同時(shí)可排除其他原因?qū)е碌腁FP升高。②患者均為原發(fā)病灶首次手術(shù)切除。③臨床資料完整。④患者及家屬知情同意，均簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他嚴(yán)重腫瘤疾病。②存在放化療等抗腫瘤治療史。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 取肝癌組織樣品200 mg，置于研缽內(nèi)加少量液氮研磨。研磨好的樣品加入1 mL RNAiso和200 μL三氯甲烷混勻，4 ℃下離心取上清液。上清液中加入異丙醇500 μL，混勻后離心，繼續(xù)加入無(wú)水乙醇750 μL，離心后去掉上清液，靜置風(fēng)干，電泳和Nanodrop檢測(cè)RNA純度，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(miScriptⅡRT試劑盒，德 國(guó)Qiagen公司)提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.2 qRT-PCR法檢測(cè) 在ABI7000實(shí)時(shí)PCR儀(美國(guó)Bio-rad公司)上進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，采用SYBR Premix試劑盒(日本TaKaRa公司)進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 10 s，延伸60 ℃ 1 min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。所有樣品設(shè)3管同時(shí)擴(kuò)增，取平均值。以U6為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt計(jì)算樣品中miR-146b-5p和miR-134的表達(dá)量，其中ΔΔCt=ΔCt癌組織-ΔCt癌旁組織。

1.3 觀察指標(biāo) 比較兩組miR-146b-5p和miR-134的表達(dá)水平，并對(duì)肝癌患者的臨床病理特征與miR-146b-5p、miR-134的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組miR-146b-5p和miR-134的表達(dá)情況 miR-146b-5p和miR-134在觀察組的相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 miR-146b-5p和miR-134在兩組中的相對(duì)表達(dá)量

2.2 miR-146b-5p表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 根據(jù)miR-146b-5p在觀察組中的表達(dá)狀態(tài)，將其分為高表達(dá)組(n=30)和低表達(dá)組(n=43)。miR-146b-5p的表達(dá)下調(diào)與腫瘤大小(>5 cm)、無(wú)靜脈浸潤(rùn)和TNM分期(Ⅲ/Ⅳ期)相關(guān)(均P<0.05)，與年齡、性別、有無(wú)肝硬化、血清AFP水平、Edmondson分級(jí)和有無(wú)腫瘤包膜等臨床病理參數(shù)無(wú)關(guān)(均P>0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 miR-134表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 根據(jù)miR-134在觀察組中的表達(dá)狀態(tài)，將患者分為高表達(dá)組(n=34)和低表達(dá)組(n=39)。miR-134的表達(dá)下調(diào)與腫瘤大小(>5 cm)、有肝硬化、TNM分期(Ⅲ/Ⅳ期)和無(wú)腫瘤包膜相關(guān)(均P<0.05)，與年齡、性別、血清AFP水平、有無(wú)靜脈浸潤(rùn)和Edmondson分級(jí)等臨床病理參數(shù)無(wú)關(guān)(均P>0.05)，見(jiàn)表3。

3 討論

越來(lái)越多的研究表明，miRNAs不僅參與細(xì)胞增殖、分化等生物學(xué)進(jìn)程，也在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移方面，發(fā)揮著重要作用，在腫瘤的診斷、治療及預(yù)后中顯示出重要的應(yīng)用價(jià)值[8]。miR-146b-5p作為一種調(diào)節(jié)多種癌基因表達(dá)的miRNA，在結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌和膠質(zhì)瘤中表達(dá)異常，提示其在惡性腫瘤中的表達(dá)模式具有特異性[9-11]。Cai等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-146b-5p在膽囊癌組織中表達(dá)下調(diào)，并與腫瘤大小及細(xì)胞分化有關(guān)；但也有研究表明，miR-146b-5p在胃癌近端切緣組織中的高表達(dá)是導(dǎo)致胃癌復(fù)發(fā)較高、患者預(yù)后較差的重要危險(xiǎn)因素[13]。miR-134是Dlkl/Di03印記基因區(qū)域的一個(gè)miRNA，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。研究表明，miR-134在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-134的表達(dá)水平可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與侵襲[14]。

表2 miR-146b-5p與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系[n(×10-2)]

表3 miR-134與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系

本研究結(jié)果顯示，miR-146b-5p和miR-134在肝癌組織中的相對(duì)表達(dá)量均低于在癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量，提示miR-146b-5p和miR-134在肝癌組織中的表達(dá)下調(diào)。miR-146b-5p的表達(dá)降低是一個(gè)不利因素，可能與肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲的紊亂有關(guān)。Li等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-146b-5p在肝癌組織中呈低表達(dá)狀態(tài)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA MALAT1可下調(diào)miR-146b-5p的表達(dá)，與本研究結(jié)果一致。以往研究表明，miR-134能夠靶向干細(xì)胞相關(guān)基因，并參與調(diào)控干細(xì)胞的分化及腫瘤的發(fā)生發(fā)展[16]。Li等[17]的研究結(jié)果顯示，miR-134在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)下調(diào)，影響癌細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲，進(jìn)一步表明miR-134的表達(dá)下調(diào)可能與癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲有關(guān)。為探討肝癌組織中中miR-146b-5p和miR-134與患者臨床病理特征的相關(guān)性，本研究根據(jù)miR-146b-5p和miR-134在肝癌組織中的表達(dá)狀態(tài)，將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，研究結(jié)果顯示，miR-146b-5p的表達(dá)下調(diào)與腫瘤大小(>5 cm)、無(wú)靜脈浸潤(rùn)和TNM分期(Ⅲ/Ⅳ期)相關(guān)，miR-134的表達(dá)下調(diào)與腫瘤大小(>5 cm)、有肝硬化、TNM分期(Ⅲ/Ⅳ期)和無(wú)腫瘤包膜相關(guān)，但二者與患者的年齡、性別、血清AFP水平和Edmondson分級(jí)等臨床病理參數(shù)無(wú)關(guān)，提示miR-146b-5p和miR-134的表達(dá)下調(diào)可能與肝癌臨床惡性表型密切相關(guān)。TNF受體相關(guān)因子6(TRAF6)是一種泛素連接酶，被證實(shí)是miR-146b-5p在肝癌細(xì)胞中的直接靶點(diǎn)，二者之間的關(guān)系呈負(fù)相關(guān)。TRAF6可誘導(dǎo)Akt磷酸，促進(jìn)腫瘤組織的生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移，而miR-146b-5p可降低體內(nèi)外TRAF6的表達(dá)，從而抑制肝癌腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[18]。此外，miR-146b-5p還可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達(dá)，這或許也是miR-146b-5p可降低肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移的原因[15]。一項(xiàng)有關(guān)miRNAs調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌細(xì)胞遷移的研究發(fā)現(xiàn)，miR-134對(duì)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移具有抑制作用，miR-134可通過(guò)抑制β1整合素蛋白(ITGB1)的過(guò)度表達(dá)，降低腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[19]。此外，miR-134也可靶向K-ras基因，并控制在肝癌惡性和發(fā)展中起著重要作用的肝細(xì)胞核因子4α(HNF4α)的表達(dá)發(fā)揮腫瘤抑制作用[20]。因此，通過(guò)上調(diào)miR-146b-5p和miR-134在肝癌組織中的表達(dá)，或可成為肝癌治療的潛在途徑。

4 結(jié)論

肝癌組織中，miR-146b-5p和miR-134表達(dá)水平下調(diào)，可能參與肝癌的發(fā)生和發(fā)展，與肝癌臨床惡性表型密切相關(guān)。由于條件限制，本研究仍存在一定不足，有關(guān)miR-146b-5p和miR-134對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲的影響，二者的表達(dá)水平對(duì)肝癌患者預(yù)后及復(fù)發(fā)的影響等未展開(kāi)研究，有待后續(xù)進(jìn)一步完善。