蘋果壞死花葉病毒實時熒光定量PCR 檢測體系的建立*

胡國君，張尊平，范旭東，任 芳，馬勉娣，張秀英，魯興凱，董雅鳳

（1 中國農業科學院果樹研究所，國家落葉果樹脫毒中心，遼寧興城 125100）（2 昭通市蘋果產業發展中心）

花葉病是蘋果上的一類重要病毒病害，發生普遍，危害嚴重，典型癥狀為葉片上形成大小不一的鮮黃色或黃白色斑塊。發病后蘋果葉片葉綠素總量可降低14.80%～38.72%、凈光合速率降低 2.93%～45.83%，果實減產30%～50%[1-2]。20 世紀30 年代該病害在歐洲首次報道[3]，其病原為蘋果花葉病毒（apple mosaic virus，ApMV），我國最早的文獻記載在20 世紀50 年代末[4]。目前，我國關于該病害的研究主要集中在癥狀觀察及發生情況調查等方面，深入研究較少，根本原因是作為病原的ApMV 在我國檢測比較困難[5]。2017 年，日本學者在從我國引進的表現花葉癥狀的蘋果樹上檢測到1 種雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）等軸不穩環斑病毒屬（Ilarvirus）的新病毒，并命名為蘋果壞死花葉病毒（apple necrotic mosaic virus，ApNMV）[6]。經進一步研究確認，ApNMV 為我國蘋果花葉病的主要病原[7]，在韓國和印度的蘋果樹上也發現了該病毒[8-9]。據報道，山楂也是ApNMV 的寄主[10]。ApNMV 為正義單鏈RNA 病毒，由3 條鏈組成（RNA1、RNA2和RNA3）。RNA1 和RNA2 編碼2 個聚合蛋白，與病毒的復制相關；RNA3 編碼運動蛋白和外殼蛋白，分別位于基因組的5′和3′端[6]。

目前，蘋果病毒主要以核酸檢測為主，如常規PCR、巢式PCR、多重PCR 和實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）等。其中，qPCR作為一種靈敏度高、特異性和可靠性強、穩定性好的檢測技術，已被廣泛應用于果樹病毒檢測[11-13]。由于qPCR 是在封閉的環境下進行反應，通過收集熒光信號來判斷反應結果，與巢式PCR 等同樣靈敏度較高的檢測方法相比，具有數據讀取簡單、不易產生污染等優點。邢飛[14]建立了 ApNMV 一步RT-qPCR 探針檢測方法。本研究建立了一種ApNMV 的TB Green 染料法qPCR 檢測方法，可對田間不同生長周期不同組織部位的蘋果樣品進行檢測，有效提高了ApNMV 的檢測效率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以實驗室保存的8 株攜帶ApNMV 的蘋果樹作為qPCR 引物篩選的測試樣品，其中，‘富士’和‘響富’各2 株，‘華紅’‘天宏’‘嘎拉’、晉18 各1 株，以無毒砧木組培苗‘B9’為陰性對照。其余檢測樣品均采集于中國農業科學院果樹研究所的試驗田。

1.2 試劑及儀器耗材

Taq?酶、10×PCR Buffer（Mg2+plus）、dNTPs、PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser Perfect Real Time、TB Green?Premix Ex Taq?（Tli RNaseH Plus）和大腸桿菌感受態細胞DH5α，購自寶日醫生物技術（北京）有限公司（TaKaRa）；膠回收試劑盒購自愛思進公司（Axygen）；pTOPO-TA Vector 購自北京艾德萊生物科技有限公司；qPCR用耗材Optical Flat 8-Cap Strips for 0.2 mL tube strips/plates 和Low-Profile PCR Tubes 8-tube strip（white）、儀器CFX Connect? Real-Time System，購自伯樂生命醫學產品（上海）有限公司（Bio-Rad）；反轉錄酶M-MLV 購自普洛麥格公司（Promega）；DNA Mark II 購自北京天根生化科技有限公司；DNase/RNase Free dH2O 購自生工生物工程（上海）股份有限公司；超微量紫外可見分光光度計（DS-11）購自美國丹諾爾公司（Denovix）。

1.3 總RNA 提取及cDNA 合成

取蘋果枝條韌皮部或葉片樣品50 mg，采用吸附柱法[15]進行總RNA 提取，利用超微量紫外可見分光光度計（DS-11）進行總RNA 濃度測定及質量分析，-80 ℃保存備用。采用去除基因組DNA 反轉錄試劑盒（PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser Perfect Real Time，Takara）合成cDNA：取5×gDNA Eraser buffer 2.0 μL、gDNA Eraser 1.0 μL 及總 RNA 1 μg，加RNase Free ddH2O 至總體積為10 μL，混勻，42.0 ℃ 2 min，放冰上。然后加入含PrimeScript RT Enzyme MixⅠ1.0 μL、RT Primer Mix 1.0 μL、5×PrimeScript buffer 2 4.0 μL 和RNase Free ddH2O 4.0 μL 的混合液，混勻，37 ℃ 15 min，85 ℃5 s，產物在冰上冷卻后-20 ℃保存備用。

1.4 引物設計、鑒定及篩選

分別根據GenBank已登錄的ApNMV 3條RNA鏈上的保守序列，設計了12 對ApNMV qPCR 檢測引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

采用常規PCR 對引物的特異性進行篩選。反應體系為25 μL，含10×PCR buffer（Mg2+plus）2.5 μL、dNTP Mixture（2.5 mmol/L each）0.5 μL、10 μmol/L正向、反向引物各0.5 μL、5 U/μL rTaq? 0.125 μL和 cDNA 2 μL，用dH2O 補足至25 μL。反應條件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，35 個循環；72 ℃延伸7 min。擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

采用qPCR 對引物的檢測效果進行篩選。反應體系為20 μL，含TB GreenPremix Ex TaqII（Tli RNaseH Plus）（2X）10.0 μL、10 μmol/L 正、反向引物各0.5 μL、DNase/RNase Free dH2O 7 μL 和cDNA 2 μL。擴增條件：94 ℃預變性32 min，94 ℃10 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，40 個循環，延伸結束時記錄熒光信號。熔解曲線分析的溫度范圍是60～95 ℃，每5 s 增加0.5 ℃，以鑒別引物二聚體和非特異性擴增。

PCR 擴增產物經回收純化后與 pTOPO-TA Vector 連接，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α。挑取白色菌落進行PCR 鑒定，將陽性克隆送北京諾賽基因組研究中心有限公司測序。將獲得的序列在GenBank 數據庫中進行同源性分析。

以‘華紅’樣品100～10-7梯度稀釋的cDNA 為模板，構建qPCR 各引物的標準曲線。

表1 ApNMV 實時熒光定量PCR 引物

1.5 qPCR 擴增條件的優化

將感染ApNMV 的‘華紅’樣品總RNA 反轉錄合成的cDNA 作為模板，分別采用終濃度為200、300、400、500 nmol/L 的引物進行qPCR 擴增，根據Cq值和擴增效果篩選出每對引物的最佳濃度。在最佳引物濃度下，檢測不同引物在退火溫度分別為52.0、54.0、55.9、58.4、60.3、62.0 ℃時熒光信號的變化情況，選取擴增效果最好時的退火溫度。

1.6 qPCR 檢測的靈敏度

以‘華紅’樣品100～10-7梯度稀釋的cDNA 為模板，分別進行qPCR 和常規PCR 擴增，比較不同方法的靈敏度。

1.7 田間樣品檢測

2019 年12 月至2020 年1 月在田間從休眠蘋果枝條上采集60 個樣品（9 個樣品葉片在夏季表現花葉的癥狀），分別采用常規PCR 和qPCR 檢測ApNMV，比較2 種方法的檢測效果。

2 結果與分析

2.1 引物的篩選及鑒定

以無毒砧木‘B9’試管苗為陰性對照，選取8個ApNMV 陽性蘋果樣品進行常規PCR 檢測。12對引物在所有陽性樣品中均擴增到目標片段大小的條帶（圖1），陰性對照和未加模板的空白對照未擴增到條帶，但引物ApN2-F3/R3、ApN1-CP-F1/R1和ApN1-CP-F2/R2 的擴增產物不是單一條帶，有雜帶，引物ApN1-F2/R2 的二聚體比較明顯，引物利用率低?；厥掌溆? 對引物擴增‘華紅’蘋果樣品的PCR 產物，進行克隆轉化并送測序。將所獲得的序列在NCBI 數據庫上進行Blast 分析，結果顯示，ApN1-MP-F2/R2 的擴增序列不是ApNMV 序列，其余7 對引物的擴增序列均為ApNMV 特異序列，與GenBank 中已登錄的ApNMV 分離物的核苷酸序列同源性為93.6%～98.8%。

圖1 7 對ApNMV 引物常規PCR 擴增產物的電泳圖

選取ApNMV 陽性蘋果樣品‘華紅’和‘響富’及陰性蘋果樣品‘B9’進行qPCR 檢測。提取的3個樣品的總RNA 濃度分別為420.86、441.59、407.73 ng/L，3 對引物對3 個樣品的擴增曲線Cq值分別為ApN1-F3/R3（18.90、18.53 和34.49）、ApN2-F1/R1（17.42、17.61 和34.93）和ApN3-MP-F3/R3（17.59、17.48 和34.79）。內參引物EF-1α-F/R 對2 個樣品的擴增曲線Cq值分別為15.36 和15.16，且熔解曲線為單一峰。

以‘華紅’樣品100～10-7梯度稀釋的cDNA 為模板，分別構建3 對ApNMV 特異引物的標準曲線。由表2 可知，引物ApN1-F3/R3 的擴增效率最高。

表2 各ApNMV 引物標準曲線的擴增效率、相關系數、斜率、截距

2.2 qPCR 反應體系優化

在52.0～62.0 ℃間設置了6 個退火溫度，qPCR擴增Cq值為17.35～17.62，不同溫度間的Cq值差異不明顯，僅為0.27，當退火溫度為60.3 ℃時，相對熒光強度相對較強，且熔解曲線為單一峰，作為最佳退火溫度（圖2-A）。在60.3 ℃下，4 個引物濃度間的Cq值為17.03～18.12，不同濃度間的Cq值差異較大，其中引物濃度為300 nmol/L 時，與其他3 個濃度區分明顯，Cq值最小，為17.03（圖2-B），因此，將300 nmol/L 作為最終引物濃度。

圖2 不同退火溫度（A）和引物濃度（B）下ApNMV 的qPCR 擴增結果

2.3 qPCR 檢測的靈敏度

qPCR 和常規PCR 檢測靈敏度測試結果表明，常規PCR 能檢測到稀釋倍數為10-3的ApNMV 陽性蘋果樣品的cDNA（圖3-A），而qPCR 可檢測稀釋倍數為10-5的ApNMV 陽性蘋果樣品的cDNA，此時Cq值為33.78，仍小于陰性對照的Cq值（34.49），qPCR 檢測靈敏度比常規PCR 檢測提高了100 倍（圖3-B）。

圖3 不同稀釋梯度蘋果樣品常規 PCR（A）和qPCR（B）檢測靈敏度比較

2.4 田間樣品檢測

應用常規PCR 和所建立的qPCR 方法對60 個蘋果樣品進行ApNMV 檢測，檢測部位為枝條韌皮部，常規PCR 的檢出率為51.7%，qPCR 的檢出率為56.7%。2 種方法在9 個有花葉癥狀的蘋果樣品中均檢測到ApNMV；在未表現癥狀的蘋果樣品中，qPCR 檢測到ApNMV 的數量比常規PCR 多檢測到3個。

3 結論與討論

病毒病已然成為危害我國蘋果產業的重要病害，按癥狀表現可分為潛隱性和非潛隱性病害2 大類型?；ㄈ~病是重要的顯癥病毒病害，在我國各個蘋果產區均有發生[7,17]。病毒病不能通過化學藥劑進行防治，栽植無病毒苗木是最有效的防控措施，而建立靈敏、可靠、快速的病毒檢測技術可為病毒病防控提供重要的技術保障，同時對蘋果苗木和種質資源的認證及檢疫工作也具有重要意義。受病原的限制，我國對蘋果花葉病的檢測技術研究還比較少。

本研究針對已報道的ApNMV 分離物3 條RNA鏈的保守區域設計12 對引物，分別進行常規PCR擴增和目標片段的克隆測序，通過擴增效果比較及序列比對分析，確定7 對ApNMV 特異引物；進一步比較7 對引物對2 個陽性樣品擴增曲線的Cq值，分別從3 條鏈上各篩選出1 對可用于qPCR 檢測引物；最后通過構建標準曲線，獲得3 對引物的擴增效率，確定引物ApN1-F3/R3 用于ApNMV 的qPCR分析。通過引物濃度和退火溫度的優化，建立了以ApN1-F3/R3 為引物的qPCR 檢測方法，可特異性檢測ApNMV，大大提高了檢測效率，靈敏度是常規PCR 檢測的100 倍。該檢測方法適用范圍廣，對不同生長時期和不同部位的蘋果樣品均有良好的檢測效果。

引物的特異性、病毒在樣品中的含量和取樣時間是影響以核酸為基礎的病毒檢測方法的關鍵因素[18]。此外，病毒群體的遺傳多樣性也影響檢測效率，病毒基因組高度變異可直接導致檢測失敗或假陰性出現[12]。與其他方法相比，qPCR 無需電泳凝膠和染色，節省了病毒檢測的時間，并具有特異性強、靈敏度高、病毒可以被量化等優點，能夠滿足針對各種類型的植物樣品中ApNMV 的檢測和帶毒量測定。本研究為蘋果脫毒苗提供了有效的認證檢測方法，也為ApNMV 的流行監測與種群生態學研究提供了支撐。