-20℃保存1年后對乙型肝炎病毒DNA定量檢測的影響

韋藍珍

摘要：目的 探討在-20±5℃的條件下保存，保存時間1年之后是否對乙肝病毒 DNA熒光定量檢測的影響。方法 1份結果為n×103的標本分裝成若干份，分成A組和B組，先檢測A組，隨機的與日常標本檢測，B組是1年后再隨機與日常的標本進行檢測，查看HBV DNA定量檢測結果的變化。結論 據本實驗室的實驗結果來看，在-20±5℃的條件下保存標本1年后，再進行乙肝病毒 DNA定量檢測，將檢測結果進行配對t檢驗，結果有顯著的差異，P<0.001。所以想要保存時間更長的標本來做相關的研究，需要選擇更合適的條件和方式來保存標本，才能讓標本的檢測結果更加穩定。

關鍵詞：-20±5℃;乙肝病毒 DNA;1年;定量

【中圖分類號】R512.3 【文獻標識碼】A 【文章編號】1673-9026（2021）04-328-01

肝炎仍是我國目前常見的傳染病，最常見的是乙型性肝炎，乙型肝炎病毒感染是主要的原因，主要的傳播途徑是經血液傳播。被乙型肝炎病毒感染后，更容易引起肝功能的異常，從而導致肝硬化、肝癌等疾病，危害性較大。目前臨床上常用的方法有膠體金法、化學發光法、酶聯免疫法、PCR法等，來檢測是否被乙型肝炎病毒感染及治療的效果，由于PCR法的靈敏性和特異性較高，所以本方法在臨床上比較受歡迎 。根據各個實驗室的實際情況的不同，有些實驗室是常溫下保存，有些是4℃的條件下保存，保存時間也不一致，有報道血清標本室溫下保存短期保存3d、4℃保存7d對PCR檢測HBV DNA含量無顯著的差異[4]，-20℃條件下保存3個月對HBV DNA熒光定量檢測結果無顯著影響[1]。但是遇到特殊情況或者科研的需要，往往需要把標本保存更長的時間再進行檢測，如果保存時間長達1年是否對HBV DNA的檢測結果產生影響。

1.實驗方法

1.1標本的處理和保存 取一份檢測結果為n×103的標本，凍融至室溫之后，用EP分裝，分裝之后保存于-20±5℃的冰箱內，每次的取出一支與日常的標本同時做實驗。實驗選用的試劑是圣湘生物科技股份有限公司的乙型肝炎病毒核酸測定試劑盒，實驗方法是實時熒光定量PCR的方法，實驗的操作步驟嚴格按照試劑的說明書進行。

1.2實驗的步驟

1.2.1試劑的準備 （在試劑準備區進行）

1.2.1.1取出包裝盒中的各組分和同一批號的核酸釋放劑，室溫放置，將其溫度平衡至室溫后，混勻后備用

1.2.1.2根據待測標本、陰性對照、陽性對照以及定量參考品的數量，按比例（反應液38ul/人份+酶混合液2ull/人份+內標0.2ull/人份）取相應量的反應液、酶混合液及內標，充分混勻配成PCR混合液，瞬時離心備用

1.2.2 標本處理及加樣（在樣本處理區進行）

1.3從-20±5℃的冰箱中取一支已分裝好的標本，室溫放置，將其溫度平衡至室溫

1.4取相應數量的PCR反應管，每管加5ul的核酸釋放劑后加5ul的標本，靜置10min，加配好的PCR混合液40ul，蓋上管蓋，2000rPm離心30秒。

1.4.1 PCR擴增（在擴增與分析區進行）

1.4.1.1將PCR反應管加入擴增儀樣品槽，按對應的設置陰性對照、陽性對照、定量參考品及待測標本，并設置樣本名稱和定量參考品的濃度

1.4.1.2選擇對應的循環參數，進行實驗

1.4.2結果分析

反應結束后，根據分析后圖像的相關的數值，調整閾值線，使得各項參數符合質量控制的要求，將實驗的結果傳至LIS系統上

2.兩組實驗的結果

A組的實驗從2020年1月至2020年4月，總共做了20次。B組的實驗從2021年3月至2021年4月，總共做了23次，取結果最接近的20次結果與A組進行比較，兩組的檢測結果如下表所示：

3.結論

近年來，各實驗室的實驗條件都有了很大的改善，使得實驗的標本保存的時間更長，有報道-20℃保存標本3個月對HBV-DNA熒光定量檢測無顯著的影響[1]，但是若遇到特殊情況或科研的需要，往往需將標本保存更長的時間，收集一定數量的標本來進行研究探討，但是保存時間長達1年以上是否對實驗結果有影響，需要進一步的研究探討。由上述的實驗結果來看，-20±5℃的條件下保存標本，1年以后用同樣的試劑和方法進行HBV DNA定量熒光檢測，A組20次的平均值是4.836×103IU/ml，B組20次的平均CT值是2.646×103IU/m，雖然結果都是10的3次方，但是結果還是有明顯的下降，將兩組數據進行配對t檢驗，P<0.001，結果有顯著的差異。這樣的結果可能對于臨床治療用藥及效果監測的影響不是特別大，但要是用于科研或者特殊需要，還是有很大的影響。檢測結果下降的原因可能是：（1）這兩組實驗是在不同的儀器上進行的，由于儀器的性能有所差異導致實驗結果的差異。下次研究最好能在同一臺儀器上進行，而且儀器需要定期校準，校準合格、儀器狀態良好的情況下進行實驗。（2）由于標本保存時間較長，中途可能出現停電導致冰箱內溫度的變化，標本存在反復凍融的情況，從而導致HBV DNA熒光定量檢測的結果有所下降。（3）標本保存時間比較長，乙型肝炎病毒的DNA在一定程度上可能會有所降解，降解的幅度與保存時間長短的關系有待研究。另外，在-20℃與-70℃兩種不同的條件下保存，核酸的穩定性關系，也有待于研究。（4）可能是選擇研究標本的原因，此次選擇定量值是n×103的標本，本試劑盒的定量線性范圍是1.0×102～5.0×109IU/ml，在此范圍內，此標本濃度值相對來說是低值，檢測值下降可能會比較明顯，如果選擇中值、高值的標本下降可能沒這么明顯，為了讓檢測結果更具可比性，還應該選擇中值和高值的標本一起平行試驗進行分析。所以如果科研或者特殊需要的情況下，需要將標本保存更長的時間來檢測HBV DNA的含量，就需選擇更合適的條件和方式來保存標本，使得結果更加的穩定，更具科研價值，為我國乙肝病毒的檢測和乙型肝炎的患者的治療及監測做貢獻。

參考文獻

[1]胡玉弘 陳玲玲 馮軍.標本存放時間對熒光定量PCR結果的影響.中國醫學創新 2010年8月第7卷第24期

[2]莊養林1，熊麗紅1，張鵬飛1，王芳1，陳丹2.溶血、脂肪血及保存條件對HBV DNA、HIV RNA核酸檢測的影響.天津醫藥 2017年10月第45卷第10期

[3]鄭建中1 王 青2 王鳳華2 王麗萍3.標本因素對熒光定量PCR法測定乙肝病毒DNA的影響.醫學檢驗與臨床 2008年第19卷第5期

[4]馬彩云.標本因素對HBV DNA測定的影響.中外健康文摘 2011年11月第8卷第42期

[5]崔永利.核酸檢測法對血液標本內乙肝病毒的檢測價值分析.影像學及診斷檢驗 2021年3月第5期

廣西科技大學第一附屬醫院?廣西柳州?545002