呼吸系統疾病生物樣本采集保藏管理技術標準和規范

國家呼吸系統疾病臨床醫學研究中心生物樣本庫專家組

生物樣本作為基礎及臨床研究的寶貴資源，對推進臨床診療能力、提高精準醫學研究水平都具有重要的現實意義[1]。我國呼吸系統疾病生物資源庫建設尚處于初級階段，普遍缺乏標準化操作流程[2]。除通用樣本，例如血液、尿液、手術病理組織外，呼吸系統疾病特有樣本還包括痰液（包括誘導痰）、胸腔積液、支氣管肺泡灌洗液（BALF）、咽拭子浸液、支氣管黏膜活檢組織以及針刺活檢組織等。同時，還應注意感染性疾病樣本具有傳染性。因此，樣本采集和保藏時應區別對待，并遵循相應標準操作規程。本文重點闡述呼吸系統疾病生物樣本采集、保藏、管理技術標準和規程。

1 標準操作規程

生物樣本采集保藏應遵循的流程[3]：①知情同意。②登記臨床信息，打印條碼。③采集樣本。④入庫前處理。⑤入庫登記。⑥入庫儲存。⑦管理、質控。⑧申請出庫、科學研究。

1.1 血液樣本采集和保藏

1.1.1 準備

運輸箱、采血針，真空采血管。常用采血容器用途見表1。

表1 常用采血管用途

1.1.2 采集

抗凝管、非抗凝管各1 管（5 mL）。

1.1.3 處理

1.1.3.1 血漿 ①分離：離心力815 g，10 min，4℃。②提取：取上清液。③二次離心：離心力2500 g，10 min，4℃。④分裝：取上清液[4]。

1.1.3.2 血清 ①凝血：30 min，室溫。②離心：離心力1500 g，10 min，4℃。③分裝：取上清液[4]。

1.1.3.3 血凝塊 ①分離：分離血清。②混勻：無菌玻璃棒混勻。③分裝：2 支凍存管（血凝塊體積1 cm3）[5]。

1.1.3.4 白細胞 ①分離：a）預熱：淋巴細胞分離液、RPMI1640 培養液至室溫。b）提取：加入RPMI1640（1∶1）。c）鋪血：加入淋巴細胞分離液（3 mL）。d）離心：離心力450 g，30 min，室溫。e）吸取：白膜至5 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS）離心管。f）離心和洗滌：離心力450 g，1 min，室溫；棄上清液，加入5 mL PBS 再次洗滌、離心。②程控降溫儀處理：a）混勻：棄上清液，加凍存劑保護液3 mL。b）分裝：3 支凍存管中（每支1 mL）。c）降溫：每分鐘降1℃，直至-80℃。或RNAlater 處理：a）混勻：棄上清液，加入3 mL RNAlater。b）分裝：3 支凍存管中（每支1 mL）。c）過夜：置4℃冰箱。見圖1。③注意事項：a）處理時間＜1 h。b）離心機自然降速。c）無菌操作。d）凍存劑保護液預先配置并冷凍，后續置于冰上操作[6]。

圖1 白細胞處理流程圖

1.1.4 保藏

①全血：-80℃。②血清、血漿：液氮氣相或-80℃。③血凝塊：-80℃。④白細胞：-80℃[6]。血液標本采集和保藏流程見圖2。

圖2 血液標本采集及保藏流程圖

1.2 尿液樣本收集和保藏

1.2.1 準備

清潔外陰；使用合格容器。

1.2.2 收集

按要求收取樣本[7]（表2），具體流程見圖3。

表2 常用尿液樣本種類

圖3 尿液樣本采集和保藏

1.2.3 處理

立即送檢，不能立即可置于2～8℃保存。

1.2.4 保藏

①短期：4℃冰箱。②長期：含防腐劑容器，-20℃冰箱[8]。防腐劑添加見表3。

表3 尿液樣本防腐劑添加

1.2.5 注意事項

①晨尿為宜。②嬰幼兒可用黏附劑收集袋。③容器材質透明、穩定。④注明標記。⑤避免污染。⑥運輸、保藏需避光。

1.3 痰液樣本采集和保藏

1.3.1 準備和采集

①詢問癥狀及肺功能。②沙丁胺醇氣霧劑：適用于一秒用力呼氣容積（FEV1）60%～80%，且無氣促者，霧化前10 min，400 μg。③高滲鹽水霧化：單一濃度法（3%或4.5%）或梯度濃度法（3%、4%、5%）；霧化10 min后漱口、擤鼻、咳嗽；FEV1＜60%或存在氣促無需霧化[9]。

1.3.2 處理

1.3.2.1 痰上清液 ①采集：痰栓。②稱重。③孵育：加入8 體積杜氏磷酸鹽緩沖液（D-PBS）。④渦旋：15 s，冰上孵育15 min。⑤離心：790 g，4℃，10 min。⑥分裝：取上清液，等分。

1.3.2.2 細胞涂片 ①采集并稱重。②孵育：加入4 體積的0.1%二硫蘇糖醇，渦旋15 s，冰上孵育15 min。③過濾：300 目濾布。④灌板計數：臺盼藍染色方法計數。⑤離心：790 g，4℃，10 min。⑥制片：涂片2 張，室溫風干，甲醛固定。

1.3.2.3 細胞團塊 ①混合：細胞懸液1 mL 轉移至含2 mL 核糖核酸酶微量離心管。②離心：400 g，4℃，5 min，棄上清液。③懸浮：500 μL RNAlater 細胞試劑懸浮細胞團塊[9]。

1.3.3 轉運及保藏

①痰上清液、細胞團塊：“干冰”低溫運送，-80℃下儲存。②細胞涂片或細胞離心涂片：室溫下運送、儲存。見圖4。

圖4 誘導痰/痰留取、處理、保藏流程圖

1.3.4 注意事項

如未能及時處理，樣本置于4℃，放置時間＜2 h。

1.4 組織病理（含支氣管黏膜及TBNA）樣本采集和保藏

1.4.1 組織樣本處理

1.4.1.1 準備及采集 ①清洗。②取材：病變及對照組織。③切割：根據需要，選擇快速冰凍、RNAlater 保存、石蠟包埋和最佳切割溫度（OCT）包埋等中一至數種。④記錄：病理診斷和處理方法。

1.4.1.2 處理方法 ①快速冰凍：處理流程參見《組織樣本快速冰凍》[10]。②RNAlater 處理：處理流程參見《組織樣本RNAlater 處理》[10]。③OCT 包埋：處理流程參見《組織樣本OCT 包埋及冰凍切片制作》[10]。④石蠟包埋：處理流程參見《組織樣本石蠟包埋及石蠟切片》[10]。

1.4.2 組織樣本保藏

①快速冰凍：凍存管，液氮氣相環境。②OCT 包埋：凍存管，-80℃。③冰凍切片：切片盒，-20℃。④石蠟包埋：干燥、室溫。⑤石蠟切片：切片盒，干燥、室溫[10]。采集與儲存流程見圖5。

圖5 組織病理樣本采集和保藏流程

1.5 BALF 樣本采集和保藏

1.5.1 準備

①評估操作風險。②預熱灌洗液（蒸餾滅菌水，37℃）。③樣本罐置于冰上。

1.5.2 采集

①部位：病變段，彌漫性病變選擇右肺中葉或左上肺舌段。②灌洗量：每次25～50 mL，總量60～120 mL。③回收：50～100 mmHg 負壓吸引，回收率≥30%。④過濾：回收液置于冰上。雙層無菌紗布過濾，裝入滅菌容器，記錄總量[11]。操作流程見圖6。

圖6 肺泡灌洗液留取、處理、保藏流程圖

1.5.3 處理

1.5.3.1 BALF 上清 ①轉移：10～15 mL 至離心管，剩余液體轉移至50 mL 管。②離心：1000 g，4℃，5 min。③提取：留取上清液。④儲存：保留為10×1 mL 等份和1×50 mL，標注。

1.5.3.2 沉渣涂片 ①提取：離心所得細胞沉淀。②混勻：添加生理鹽水，混勻。③離心：轉移60 μL 細胞懸液至4 個細胞離心涂片機每一個的漏斗，1000 g，5 min，4℃。④調整：顯微鏡下調整濃度。⑤制片：染色2 片；另外2 玻片完成第一步固定。使用Shandon 差異-快速試劑盒[11]。

1.5.4 保藏

①上清液：-80℃。②細胞涂片或離心涂片：室溫[12]。

1.5.5 注意事項

①內鏡頂端緊密楔入支氣管開口。②麻醉充分。③無菌操作。④大氣道病變，第一管回收液單獨處理，非大氣道疾病可混合后分送。

1.6 胸腔積液樣本采集和保藏

1.6.1 采集

按診療常規胸腔穿刺留取[13]。

1.6.2 處理

①第一管微生物培養，第二管常規檢查，第三管生化檢查，第四、五管樣本儲存。②如不能送檢可加入乙醇固定，病理和細胞學檢查采用EDTA 鹽抗凝，化學檢查采用肝素抗凝。③無菌操作[14]。

1.6.3 保藏

①-40℃或-80℃冰箱。②凍融后不能再次入庫。③每3 個月抽樣檢測[14]。采集與儲存流程見圖7。

圖7 胸腔積液留取、處理、保藏流程圖

1.7 鼻咽拭子樣本采集及保藏

1.7.1 準備

評估口鼻咽或口咽部情況。

1.7.2 采集

1.7.2.1 咽拭子 無菌拭子左右兩面及拭子頭部刮取扁桃腺兩側及咽后壁的分泌物[15]。

1.7.2.2 鼻拭子 無菌拭子以垂直面部的方向輕輕插入鼻道內鼻腭處，停留15～30 s，輕輕旋轉3 次，緩慢退出[16]。

1.7.3 處理

①拭子頭部折斷后置于裝有病毒運送液的螺口塑料試管。②試管口及棉簽塞火焰上消毒后旋緊。③搖動試管，混勻。

1.7.4 轉運

4℃環境。

1.7.5 保藏

①儲存＜48 h：4℃冰箱。②儲存＞48 h：-70～-80℃冰箱。

1.7.6 注意事項

①進食2 h 內勿采集。②樣本容器無菌、干燥。③真菌培養須采集潰瘍表面分泌物。

1.8 唾液樣本采集及保藏

1.8.1 準備

①禁食1 h。②清水漱口。③漱口后等待10 min。④牙齦或口腔出血不宜留取。

1.8.2 采集

1.8.2.1 混合性唾液 ①棄去最初唾液，留取后續唾液2 mL。②舌下放置干燥脫脂紗布，10 min 后取出，擠出唾液備用[17]。③商業用唾液收集管（遵循相關說明書）。

1.8.2.2 單一腺體唾液 ①腮腺唾液：口腔科醫生采集。②頜下腺唾液：塑料吸盤固定于舌下腺區收集[17]。

1.8.3 處理

①-20℃冰箱。②4℃環境中≤2 h。

1.8.4 保藏

＞6 個月，-80℃[17]。

1.9 高致病性樣本采集和保藏

1.9.1 樣本采集

①呼吸道：72 h 內采集。②血液：急性期盡快收集，恢復期在發熱后3 周內收集。③尿液：置于無菌密閉容器，安全加蓋并封以石蠟。④胸腔積液：置于無菌塑料螺口管。⑤肺組織活檢：在超聲或X 線定位下，經皮穿刺取肺組織活檢樣本，置于含3 mL 采樣液的塑料螺口管中。

1.9.2 樣本包裝

①生物安全Ⅱ級實驗室生物安全柜內分裝成一式三份：一份當地檢測用，一份送第三方檢測，一份儲存以備復核[18]。②每件塑料袋密封一份樣本。③填寫“疑似人感染高致病性疾病/不明原因肺部感染樣本送檢單”，用塑料袋密封。④注意事項：a）收集容器帶螺旋蓋，內有墊圈、耐冷凍，密封性好。b）樣本外泄需立刻用消毒毛巾擦拭，后用安爾碘消毒液反復擦拭5 遍以上。c）采集者需Ⅱ級以上防護；如防護用品受污染，應立即更換。d）所有樣本均需注明姓名、床號、ID 號及收集日期。e）長途轉運需4℃保存。f）一次性采集器械用后即焚燒銷毀[19]。

1.9.3 樣本保藏

①24 h 內置于4℃保存；24 h 內無法檢測置于-70℃或以下儲存；如無-70℃儲存條件，則于-20℃儲存。②血清4℃保存3 d、-20℃以下長期儲存。③儲存地點應符合傳染病規范，設立專庫或專柜單獨儲存[20]。采集及保藏流程見圖8。

圖8 高致病性樣本留取、處理、保藏流程圖

2 樣本入庫管理規程

2.1 目的

規范儲存管理，保證儲存質量。

2.2 適用范圍

長期儲存樣本。

2.3 人員職責

負責樣本入庫，對儲存容器和設備進行監督管理。

2.4 設備要求

①室內溫度、濕度。②氧含量監測報警裝置。③照明調節設施。④消防設施。⑤應急電路。⑥門禁系統。⑦緊急處置預案。⑧緊急聯系人名單[21]。

2.5 入庫任務

①樣本質量控制。②確保樣本位置唯一性和可溯源性。③實時反映樣本位置信息。

3 在庫樣本管理和質量控制

3.1 目的

正確、安全地儲存樣本。

3.2 適用范圍

保證樣本儲存質量，確保樣本儲存位置正確。

3.3 人員職責

核實庫存，確保信息正確。

3.4 庫存核實

①至少一年一次。②隨機選取至少1‰新入庫樣本量。③安全儲入控制措施。④安全防護措施。⑤避免樣本損耗。⑥核實后樣本歸位。⑦記錄結果。⑧更正錯誤信息及數據。⑨記錄糾錯措施，填寫分析報告[21]。

3.5 冷鏈系統管理和維護

冷鏈由基礎設施、儲存設備、凍存耗材、監控設備等構成[22]。

3.5.1 基礎設施

①冰箱與液氮設備分開放置。②冰箱背靠墻，或間隔15 cm 以上背對背擺放。③配置備用電源。④重要樣本需備份，并分開放置。

3.5.2 儲存設備

①-80℃儲存設備（超低溫冰箱）。②-140℃儲存設備（液氮氣相）：需備液氮自動檢測設備和自動加注設備。③-196℃儲存設備（液相液氮罐和液氮儲存箱）。

3.5.3 監控設備

包括冰箱溫度探頭、冰箱運行溫度記錄，液氮容器液位監控、遠程報警、視頻監控等。

3.5.4 凍存耗材

建議使用帶有螺紋密封的凍存管，外旋凍存管適用于超低溫冰箱，內旋凍存管適用于液氮氣相或深冷冰箱。

4 樣本出庫管理規程

4.1 目的

確保樣本及其信息的出庫符合規定。

4.2 需用材料

液氮、干冰、樣本盒、手套。

4.3 參與人員

資源庫技術員、管理員、樣本用戶。

4.4 所需條件

①提交申請。②審核批復。③簽署協議。④信息跟蹤。⑤信息隱私化。

4.5 審批程序

①申請方提出申請，管理方登記“發放單”。②申請批準后，管理方批準“發放單”。③管理方查詢樣本加入“發放單”。④管理方移交樣本。⑤申請方簽收，管理方確認“發放單”。

5 樣本運輸標準操作規程

5.1 樣本運輸程序

發貨方與收貨方書面確認：①發貨通知單。②發貨清單。③物流跟蹤。④收樣確認。⑤審查包裝測試報告。⑥送樣測試。

5.2 樣本運輸條件

5.2.1 法規要求

①符合國際、國內法規。②參與運送員工具備資質。

5.2.2 環境要求

①溫度要求：a）20～30℃：隔熱包裝。b）2～8℃：冰塊或凝膠袋（-15℃）。c）-20℃：冷凍凝膠袋（-20℃或-20℃以下）。d）-70℃：干冰顆粒、干冰塊、干冰片。包裝貼上危險物品標識符。e）≤-150℃：干燥液氮罐運輸。②濕度要求：濕度敏感樣本，需加入干燥劑。③時間要求：交由具備資質的快遞公司。④數量要求：分為多個小包裝運輸，備充足冷凍劑[23]。

5.2.3 注意事項

①樣本置于冷凍劑間。②剩余空間用塑料泡沫填充。③清除殘留標簽。④運輸容器定期消毒。⑤空運單不可重復使用。

5.3 國際運輸

①了解接收國家法律、法規。②預估運輸時間。③雇傭有資質貨代公司或快遞公司。④遭遇延誤，可委托快遞公司補充冷凍劑。

6 樣本銷毀管理

包括生物樣本和相應材料的銷毀，銷毀樣本符合法律法規要求[24]。

6.1 申請銷毀

①提出申請，附銷毀質檢報告，第三方隨機抽檢復核。②申請批準后，由第三方銷毀。

6.2 實施銷毀

①核對待銷毀樣本。②將樣本連同容器放入防生物危害銷毀袋，移交第三方。③記錄銷毀原因、批準和執行時間及執行人員。④刪除樣本數據，保留知情同意撤銷申請和樣本銷毀記錄。

7 科學研究

樣本使用要做到資源共享，物盡其用；科學研究后樣本如有剩余，對于可反復使用的樣本，在確保未被污染及可再用情況下，應運回資源庫再次入庫；對于不可反復使用的樣本，不能再次入庫。

執筆：丁永杰，羅文婷，李慶云，鄭勁平。

專家組成員（按姓氏拼音排列）：丁永杰（上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院，上海交通大學醫學院呼吸病研究所），顧文超（上海市浦東新區人民醫院），郝創利（蘇州大學附屬兒童醫院），黃樹棟（陽江市人民醫院），李國平（成都市第三人民醫院），李慶云（上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院，上海交通大學醫學院呼吸病研究所），李雪琴（山西晉城無煙煤礦業集團有限責任公司總醫院），劉恩梅（重慶醫科大學附屬兒童醫院），劉光輝（武漢大學中南醫院），劉清華（梅州市人民醫院），盧震輝（寧夏醫科大學總醫院），羅文婷（廣州醫科大學附屬第一醫院，國家呼吸系統疾病臨床醫學研究中心），邱晨（深圳市人民醫院），任蕾（上海市第四康復醫院），榮光生（合肥市第三人民醫院），孫云（銀川市婦幼保健院），田東波（廣州醫科大學附屬第六醫院），王琪（大連醫科大學附屬第二醫院），魏春華（濰坊衛恩醫院），魏立平（廣州醫科大學附屬第三醫院），余詠梅（昆明醫科大學附屬第一醫院），張宏（甘肅省人民醫院），張淇釧（汕頭市中心醫院），張蓉芳（甘肅省婦幼保健院），張玉焱（惠陽三和醫院），趙冰融（中南大學湘雅醫院），鄭勁平（廣州醫科大學附屬第一醫院，國家呼吸系統疾病臨床醫學研究中心），鄭智遠（中南大學湘雅醫院）。