循環血腫瘤細胞檢測在根治性膀胱全切術后評估中的臨床研究

康 曦 李 琴 劉 方

江西省萍鄉市人民醫院泌尿外科，江西萍鄉 337000

膀胱癌是泌尿系統常見的惡性腫瘤，病死率和發病率居于我國泌尿系統腫瘤的首位，多呈浸潤性發展，惡性程度較高[1]。根治性膀胱全切術是治療膀胱癌的有效手段，但5年生存率僅為26%～64%，大部分患者死于腫瘤轉移，目前尚無有效的方法預測膀胱腫瘤的復發、進展、轉移以及評估術后治療效果[2-3]。血行傳播是惡性腫瘤遠處轉移的重要途徑，循環血腫瘤細胞（CTC）是指從原發病灶脫落進入血液循環的細胞，在一定條件可在遠處器官定植，形成惡性腫瘤轉移病灶，其存在是血行傳播的表現[4-5]。CTC 與直腸癌、乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤的轉移、復發相關，是對惡性腫瘤患者無瘤生存預測的重要指標[6]。本研究旨在分析CTC 檢測在根治性膀胱全切術后評估中的應用價值，為臨床個體化治療方案的選擇提供依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年6月～2019年10月萍鄉市人民醫院門診就診，擬行根治性膀胱全切術的90 例膀胱癌患者作為研究組，選擇同期就診于萍鄉市人民醫院的10 例非腫瘤患者作為對照組。研究組中，男61 例，女29 例；年齡41～78 歲，平均（66.24±8.67）歲；腫瘤直徑≥3 cm 有38 例，＜3 cm 有52 例；多發腫瘤28 例，單發腫瘤62 例；鱗狀細胞癌1 例，單純尿路上皮癌77 例，尿路上皮癌合并小細胞神經內分泌癌1 例，尿路上皮癌合并鱗狀或腺樣分化11 例。對照組中，男6例，女4 例；年齡40～81 歲，平均（66.31±8.75）歲；腎盂輸尿管連接處狹窄3 例，結石6 例，精索靜脈曲張1 例。兩組患者的一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經醫學倫理委員會審核批準。納入標準： ①研究組患者均經病理診斷確診為膀胱癌者；②美國麻醉醫師協會（ASA）分級為Ⅰ～Ⅲ級者；③術前未接受任何抗腫瘤治療者；④行根治性膀胱全切術治療者；⑤簽署知情同意書者；⑥對照組為非腫瘤患者。排除標準：①合并其他惡性腫瘤者；②術前發現存在遠處轉移者；③精神疾患者。

1.2 方法

采用用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝真空采血管采集兩組患者7.5 mL，24 h 內富集處理。混勻后，置入50 mL 離心管中，配置3 種工作液，命名為A1、B1、C1。加A1 至45 mL，室溫下行5 min 的1900 r/min 離心操作，去除血紅素、血紅蛋白。加入B1 混勻，裂解紅細胞，室溫下行5 min 的1900 r/min 離心操作，將紅細胞裂解基質去除，所沉淀下來的即為稀有細胞和白細胞。吸取適量磁微粒，每份150 μL，混懸液置入2 mL的EP 管中，磁力架洗滌3 次。每份100 μL 比例在上述樣本中緩慢置入磁微粒，搖晃離心管，磁微粒充分混勻后，在搖床上搖動20 min，促使白細胞與磁珠結合。取3 mL C1 加入50mL 離心管，在頂層加入已處理好的樣本，按照密度梯度離心原理將磁珠和白細胞去除。行5 min 的1400 r/min 離心操作，吸取最上兩層溶液，放置在15 mL 離心管中，加入A1，行5 min的2300 r/min 離心操作，棄上清至300 μL。移動上述液體至2 mL 離心管，靠于磁力架2 min，將殘留磁珠去除，室溫下行3400 r/min 離心操作，棄上清至60 μL，滴加體積相等的固定液，混勻，涂片。取200 μL 固定液，使其完全覆蓋標本區域，置于室溫下8 min。將固定液吸除，脫水，分別將10 μL CEP8 探針加入每個標本區，蓋上蓋玻片。吸取200 μL 封片膠將玻片邊緣封住，加入載玻片放入雜交儀，變形76℃，5 min，雜交37℃，1.5 h。將標本片取出，封片膠撕去，去除蓋玻片，洗片，染色，避光保存。利用熒光顯微鏡讀片，CTC 標準（圖1～4，封三）：CD45 陰性，FISH 陽性（40 倍鏡下信號不分層，CEP8 探針信號≥3），單個細胞。

1.3 觀察指標及評價標準

比較兩組CTC 陽性率，分析CTC 陽性率與膀胱癌患者臨床病理特征關系、CTC 表達水平與膀胱癌患者預后的關系。其中臨床病理特征包括性別、年齡、吸煙史、腫瘤直徑、腫瘤數目、組織學類型、腎積水、病理分級、T 分期、復發情況等。

1.4 統計學方法

采用SPSS 21.0 軟件分析數據，計量資料使用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，Log-rank檢驗分別比較CTC 表達水平膀胱癌患者的生存差異。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者CTC 陽性率的比較

對照組中未檢出CTC，研究組中檢出CTC 有31例，陽性率為34.44%，CTC 數值為1～10 個。研究組CTC陽性率高于對照組，差異有統計學意義（χ2=4.992，P=0.025）。

2.2 CTC 陽性率與膀胱癌患者臨床病理特征關系分析

不同性別、年齡、組織學類型和是否有吸煙史、腎積水患者CTC 陽性率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；多發腫瘤CTC 陽性率高于單發，腫瘤直徑≥3 cm 的CTC 陽性率高于＜3 cm 的CTC 陽性率，≥T2 分期CTC陽性率高于＜T2 分期的CTC 陽性率，高級別腫瘤的CTC 陽性率高于低級別腫瘤的CTC 陽性率，復發患者的CTC 陽性率高于無復發患者的CTC 陽性率，差異有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 CTC 陽性率與膀胱癌患者臨床病理特征關系分析

2.3 CTC 表達水平與膀胱癌患者預后的關系

術后行長期定時隨訪，每3 個月復查隨訪一次。生存曲線顯示，CTC 陽性表達生存率高于無CTC 陽性表達患者，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖5）。

圖1 CD45 陰性（見內文第124頁）

圖2 CEP8 陽性（見內文第124頁）

圖3 細胞核（見內文第124頁）

圖4 FISH 陽性細胞合成圖（見內文第124頁）

圖5 CTC 表達與膀胱癌患者預后的關系

3 討論

膀胱癌是具有高復發、浸潤發展等特點的泌尿系統惡性腫瘤，手術是治療膀胱癌的主要方式，但術后遠處轉移和高復發率是治療膀胱癌的主要問題之一[7]。約50%的浸潤性膀胱癌在確診時已發生微轉移灶。微轉移是機體體液、組織和細胞移植物中檢測到鏡下和亞顯微水平的腫瘤殘留，是隱匿于原發灶以外的組織、非血液系統的惡性腫瘤的轉移，其發生與腫瘤組織學分級、腫瘤類型相關。微轉移灶的存在提示在臨床轉移癥狀出現之前，癌細胞在很長一段時間內便與原發灶脫落播散至循環系統中，即CTC，是腫瘤復發、轉移的最直接因素[8-11]。CTC 數量與術后總生存期和無病生存期關系密切，數量越多者術后復發率越大[12-13]。因此，檢測膀胱癌患者外周血腫CTC，對于評價膀胱癌療效和評估預后具有積極意義。

血液中CTC 的含量極其稀少，檢測CTC 前需實施富集，免疫磁珠法為常用的富集方法，包括陽性、陰性富集法，前者是讓帶有特異性抗體的免疫磁珠結合腫瘤細胞表面抗原，形成復合物，促使腫瘤細胞在磁場中停留，但因部分腫瘤細胞無表達特異性抗原，易出現假陰性結果。而陰性富集法是通過免疫磁珠結合非腫瘤細胞，使其在磁場中停留，通過磁場富集腫瘤細胞，檢出率更高[14-15]。本研究中，研究組的CTC 陽性率高于對照組；多發腫瘤的CTC 陽性率高于單發腫瘤的CTC 陽性率，腫瘤直徑≥3 cm 的CTC 陽性率高于＜3 cm 的CTC 陽性率，≥T2 分期的CTC 陽性率高于＜T2 分期的CTC 陽性率，高級別腫瘤的CTC 陽性率高于低級別腫瘤的CTC 陽性率，復發患者的CTC陽性率高于無復發患者的CTC 陽性率； 生存曲線顯示，CTC 陽性表達生存率高于無CTC 陽性表達患者，提示CTC 與膀胱癌的發生、進展、預后密切相關。CTC檢測樣本易于獲取，具有易動態監測、近似無創、高敏感性等優點，與影像學和組織學比較，CTC 能更早發現腫瘤，動態監測CTC 能間接反映腫瘤血行轉移速度、病情嚴重程度、治療后殘存腫瘤細胞，可能成為一種新型評價腫瘤療效和評估預后的手段，應用前景廣泛。

綜上所述，CTC 與膀胱癌患者腫瘤數目、腫瘤直徑、病理分級、T 分期、復發密切相關，動態檢測CTC 利于及時評估療效、盡早發現復發轉移和預后，指導臨床選擇和個體化、合理化的治療方案。