基于網絡藥理學的杞菊地黃丸治療糖尿病合并高血壓的機制研究

張 園 張世超

遼寧中醫藥大學附屬醫院醫療設備處，遼寧沈陽 110032

糖尿病是一種常見的臨床慢性代謝性疾病，其全球患病人數高達4.63 億，中國更是位居第一。高血壓作為糖尿病的一種常見并發癥，同時也是2 型糖尿病發生心血管病變的重要危險因素，其可加速損傷血管內皮，加重病情。國外有研究發現，糖尿病患者中有40%～80%的患者同時并發高血壓[1]。西醫治療主要采用控制血糖、降低血壓等方法，雖有一定的療效，但長期應用易導致肝、腎功能損害。中醫藥具有整體觀、辨證論治的治療特點，應用中藥治療本病具有很好的優勢和療效。杞菊地黃丸作為經典名方，具有滋腎養肝的作用，臨床多項研究發現，杞菊地黃丸治療本病可明顯改善患者血糖、血壓、血脂等指標，降低胰島素抵抗[2-3]。網絡藥理學是一種基于多種大數據平臺及先進的科學技術的現代化研究方法，從宏觀到微觀科學地對抽象的中醫藥理論加以詮釋[4]，闡明中藥的有效性和科學性，使之與現代醫學相接軌。本研究擬基于此研究方法，預測杞菊地黃丸治療糖尿病合并高血壓的有效活性成分及作用靶點，并進一步探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 杞菊地黃丸化學成分及靶點信息的獲取

在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）中分別以“枸杞子、菊花、澤瀉、熟地、山藥、茯苓、山茱萸、丹皮”為檢索詞，以“口服吸收率（OB≥30%），類藥性（DL≥0.18）和半衰期（HL≥4 h）”作為篩選條件，得到其有效的活性成分。在此基礎上通過PubChem 數據庫獲得這些成分的Smiles 格式，同時應用Swiss Target Prediction 數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/），設置研究物種為人類（Homo sapiens），篩選Probability＞0 的靶點。采用Uniprot 數據庫進行標準化處理，挖掘枸杞子、菊花、熟地、山茱萸、山藥、丹皮、茯苓、澤瀉八味中藥的作用靶點。

1.2 糖尿病合并高血壓靶點的篩選

以“糖尿病（diabetes）、高血壓（hypertension）”作為檢索詞，在GeneCards 數據庫（http：//www.omim.org/）、TTD 數據庫（http：//www.genecards.org/）、DisGeNET 數據庫（http：//www.disgenet.org/）中分別搜索，合并去除重復和假陽性值，獲得疾病靶點。

1.3 中藥-疾病靶點網絡構建及核心靶點的篩選

應用Venny 軟件將杞菊地黃丸中八味中藥的作用靶點與糖尿病合并高血壓的疾病靶點進行交集，繪制韋恩圖，篩選出中藥與疾病的共有靶點。將共有靶點導入String 數據庫構建蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡模型，其中蛋白種類為人類“Homo sapiens”，“highest confidence”＞0.9，應用Cytoscape 軟件進行可視化分析，以節點度值分布（degree）和介數中心性（betweenness centrality）同時在中位數以上作為篩選條件，從而獲得核心靶點。degree 和betweenness centrality 值越大，證明節點越重要。

1.4 核心靶點生物功能注釋及通路分析

將中藥復方知柏地黃丸與六味地黃丸的核心靶點導入Metascape 平臺，設置物種為人類，對其進行GO-BP 生物功能富集和京都基因和基因組數據庫（KEGG）Pathway 分析，從而進一步比較中藥復方知柏地黃丸與六味地黃丸治療代謝綜合征在生物學功能及信號通路方面的差異性。Metascape 覆蓋范圍廣泛，包含了UniProt、NCBI、DrugBank 等多個數據庫信息，同時具有一定的時效性[9]。應用Cytoscape 軟件構建核心靶點-生物功能-代謝通路網絡圖。

2 結果

2.1 杞菊地黃丸與糖尿病合并高血壓靶點的篩選

通過在TCMSP 數據庫中檢索杞菊地黃丸中八味中藥的活性成分及篩選，共收集到活性化合物枸杞子100 個。通過PubChem 及Swiss Target Prediction 數據庫，篩選得到杞菊地黃丸的作用靶點890 個。在GeneCards、TTD 及DisGeNET 數據庫對疾病靶點進行檢索、篩選，共獲得糖尿病靶點1267 個、高血壓靶點1352 個。通過Venny 軟件取交集后獲得杞菊地黃丸與糖尿病合并高血壓共有靶點138 個。見圖1。

圖1 杞菊地黃丸與糖尿病合并高血壓共有靶點韋恩圖

2.2 PPI 網絡與核心靶點分析

應用String 數據庫構建中藥與疾病共同靶點的PPI 網絡圖，見圖2。同時保存tsv 格式文件，并將其導入Cytoscape 軟件，分析網絡中所有點的拓撲參數（degree 和betweenness），篩選出degree≥6 和betweenness centrality≥5.69×10-3的靶點作為核心靶點，共得到39 個核心靶點，包括轉錄激活因子-3（STAT3）、磷脂酰肌醇激酶3（PIK3）、過氧化物酶體增殖激活受體（PPAR）、絲氨酸/蘇氨酸激酶2（AKT2）、血管內皮生長因子A（VEGFA）等。

圖2 杞菊地黃丸與糖尿病合并高血壓蛋白質-蛋白質相互作用網絡圖

2.3 核心靶點生物功能和KEGG 通路富集分析

利用Metascape 軟件分別對篩選出的杞菊地黃丸治療糖尿病合并高血壓的核心靶點進行GO-BP 生物學功能富集分析和KEGG 通路分析，發現杞菊地黃丸可通過血液循環、肽基絲氨酸磷酸化、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路等GO-BP 生物學功能發揮作用，見圖3。可通過VEGF 信號通路、ErbB 信號通路、Toll 樣受體細胞信號通路等治療糖尿病合并高血壓，見圖4。以VEFG 為其主要通路，見圖5。利用Cytoscape軟件構建核心靶點-GO-BP 生物功能-KEGG 通路網絡圖，見圖6。

圖3 杞菊地黃丸治療糖尿病合并高血壓GO-BP 生物學功能富集分析結果

圖4 杞菊地黃丸治療糖尿病合并高血壓KEGG 通路富集分析結果

圖5 VEFG 信號通路

3 討論

糖尿病、高血壓在中醫學中多歸屬于“消渴”“眩暈”等疾病，糖尿病多以陰虛為本燥熱為標，中醫多采用平肝潛陽、益氣補腎等療法。杞菊地黃丸屬于中藥制劑，臨床上經常用于治療糖尿病和高血壓等疾病。杞菊地黃丸出自清代董西園的《醫級·卷八》，是在六味地黃丸的基礎上加枸杞子、菊花而成。方中枸杞子、山茱萸、山藥、熟地等可滋補腎陰，潛陽育陰；菊花可疏風平肝，清熱明目，茯苓、丹皮、澤瀉可健脾益氣，活血化瘀。全方合用，共奏滋陰潛陽、補腎平肝之功。現代藥理學研究表明，枸杞子的主要活性成分為枸杞多糖、多酚等，可以刺激人體內源性因子，提升抗氧化酶的活力[5]。菊花主要含黃酮類、揮發油等，通過增加肝細胞中的PPAR，從而降低血糖，并具有保護血管舒張反應性、增強心肌收縮力的作用[6]。熟地中主要有多糖、5-羥甲基糠醛等，具有促進內皮細胞增殖、增強免疫力的作用[7]。山藥中主要含有多糖、氨基酸、山藥素類化合物，可增加胰島素分泌，改善受損壞的胰島β細胞功能，從而降低血糖，亦可以降低血脂，調節免疫[8]。山茱萸中主要含有環烯醚萜、黃酮、多糖等，可降低血壓，調節糖、脂等代謝過程[9]。茯苓的主要藥效成分為三萜類和多糖類等化合物，具有抑制炎癥反應、保護肝功能的作用[10]。丹皮中含有酚及酚苷類等化學成分，具有較強的降糖及保護心血管等多種作用[11]。澤瀉主要含有糖類、三萜、倍半萜等，具有利尿、降血脂、降血糖及抗氧化損傷等作用[12]。

本研究基于網絡藥理學技術，發現杞菊地黃丸的含有100 個活性化合物、890 個作用靶點，與糖尿病合并高血壓共有靶點138 個，驗證了中藥具有多成分、多靶點的特點。通過PPI 網絡進行分析，篩選出核心靶點39 個，即STAT3、PIK3、PPAR、AKT2、VEGFA 等。STAT3 參與調節細胞增殖與分化、細胞凋亡等生理過程，當機體血糖和血壓值較高時，其表達增加[13]。STAT3 可激活VEGF 信號通路，從而誘導內皮細胞的異常增殖[14-15]。PIK3R、AKT2 是構成PI3K/Akt 信號轉導通路的關鍵靶點。既往實驗證實杞菊地黃丸能夠上調PI3K、Akt 的表達[16]。PI3K/Akt 在機體高表達時，可以激活eNOS 和PPAR，抑制氧化應激反應，減少炎癥因子的釋放，從而起到保護血管的作用[17-18]。PPAR具有調節脂肪細胞分化和胰島素抵抗的作用，其激活后可保護血管平滑肌和血管內皮[19-20]。GO-BP 生物學功能富集分析和KEGG 通路分析發現杞菊地黃丸可通過血液循環、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、肽基絲氨酸磷酸化等生物學功能及VEGF 信號通路、ErbB 信號通路、Toll 樣受體細胞信號通路等發揮其治療糖尿病合并高血壓的作用。VEGF 是一種血管通透性因子，既可促進血管內皮細胞的增殖，又可誘導血管增生，同時可調節血管的通透性，參與血管內皮細胞遷移、機體修復損傷等生物學過程[21-22]。研究發現，在糖尿病合并高血壓患者體內，VEGF 含量明顯升高，且高于單純糖尿病患者和高血壓患者[23]。體內VEGF 含量過高會導致內皮細胞過度增殖，從而引起內皮細胞的功能障礙。ErbB 信號通路參與細胞的存活、增殖和其他生理反應。國外一項研究發現，ErbB2 雙重靶向抑制劑雷帕替尼可通過抑制高糖誘導的ErbBs 信號改變，從而阻止細胞凋亡和改善血管功能[24]。Toll 樣受體可使機體釋放大量炎性因子激活免疫炎癥反應，參與胰島素抵抗、胰島細胞的炎癥反應等過程，其在糖尿病合并高血壓的患者體內表達增加[25]。

圖6 杞菊地黃丸核心靶點-GO-BP 生物功能-KEGG 通路網絡圖

綜上所述，本研究采用網絡藥理學的研究方法對杞菊地黃丸治療糖尿病合并高血壓的作用機制從多方面進行了深度的挖掘，為進一步闡明中藥對疾病的干預和影響及今后的實驗研究提供了理論指導和新的思路。