脈沖群電磁場對體外培養(yǎng)成骨細胞增殖與礦化的影響

高玉海，何文芳，劉 菁，任 莉，吳思敏，陳克明

脈沖電磁場(PEMFs)為一種良好的生物物理治療方法，已有諸多文獻報道了其具有促進成骨細胞增殖與成熟礦化、增加青年大鼠峰值骨量、促進骨折愈合的作用[1-3]。因PEMFs具有無創(chuàng)傷、無感染、操作簡單、無不良反應等特點，近年有學者將其用于神經修復、腰椎間盤突出癥治療等方面的研究[4-5]。脈沖群電磁場(PGEMFs)作為PEMFs的一種改良，作用效果如何尚未有文獻報道。課題組前期已篩選出PEMFs促進成骨細胞增殖與成熟礦化的最佳作用頻率、強度和時間，但動物實驗結果表明，其存在一定的不穩(wěn)定性。故本實驗旨在通過觀察PGEMFs對體外培養(yǎng)大鼠成骨細胞(ROBs)增殖與礦化的影響，以期為增加骨形成提供新思路。

1 材料與方法

1.1PGEMFs發(fā)生裝置 PGEMFs電源由課題組聯(lián)合中國科學院蘭州近代物理研究所電源室研發(fā)(尚未申請專利)。該電源能夠實現(xiàn)脈沖波、脈沖群波的穩(wěn)定輸出，通過連接計算機，運用自主設計的控制軟件實現(xiàn)時間、頻率、強度及脈沖波與脈沖群波的不同比例混合等。電源連接線圈可產生一定范圍的均勻磁場，并能放置于細胞培養(yǎng)箱內。

1.2儀器與試劑耗材 CO2培養(yǎng)箱(Thermo Revco公司，美國)；倒置相差顯微鏡(Olympus公司，日本)；臺式高速離心機(Heraeus公司，德國)；高速冷凍離心機(湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，中國)；低速離心機(北京醫(yī)用離心機廠，中國)；酶標儀(Bio Tek公司，美國)；1000 ml、100 μl、10 μl移液槍(Eppendorf公司，德國)。

α-MEM培養(yǎng)基(Gibco公司，貨號：2090463)；胎牛血清(Lonsera公司，貨號：S711-001S)；青鏈霉素混合液(索萊寶公司，貨號：P1400)；胰蛋白酶-EDTA溶液(索萊寶公司，貨號：T1300)；Ⅱ型膠原酶(索萊寶公司，貨號：C8150)；地塞米松(Sigma公司，貨號：D1756)；維生素C(Sigma公司，貨號：A7631)；β-甘油磷酸(阿拉丁公司，貨號：D106347)；堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒(南京建成生物工程有限公司，貨號：A059-1-1)；100 mm、60 mm培養(yǎng)皿(Coring Costar公司，貨號：430167/430196)；35 mm培養(yǎng)皿(Thermo公司，貨號：150460)；一次性移液管(科進公司，貨號：1441)；1.5 ml離心管(科進公司，貨號：2211S)；10 μl、100 μl、1000 μl槍頭(科進公司，貨號：180805H、200592J、190498J)。

1.3實驗方法

1.3.1大鼠顱骨成骨細胞培養(yǎng)：取出生48 h以內的SPF級SD大鼠乳鼠(甘肅省中醫(yī)學院動物實驗中心提供，合格證號：SCXK-甘-2009-0006-152)，75%乙醇浸泡，無菌條件下取出顱骨，置入干凈的培養(yǎng)皿中，去除骨膜、血管及結締組織，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)漂洗2次。加入0.25%胰蛋白酶37℃消化15 min，棄去消化液；再加入0.1%Ⅱ型膠原酶37℃消化5次，每次12 min，收集并合并消化液，200目細胞篩過濾。收集消化液，1000 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀用含10%胎牛血清的α-DMEM培養(yǎng)液懸浮，吹打均勻后，調整細胞濃度至1×105/ml。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液1次。待細胞生長至80%融合時進行后續(xù)實驗。成骨性分化培養(yǎng)的條件為在原培養(yǎng)液基礎上加入地塞米松1×10-8mol/L、β-甘油磷酸1×10-2mol/L和維生素C 1×10-4mol/L。

1.3.2細胞增殖分析：將原代培養(yǎng)細胞用胰蛋白酶消化懸浮后，調整細胞濃度至3×104/ml,以每皿2 ml接種于60 mm培養(yǎng)皿中，24 h后根據(jù)實驗設計進行分組，每組3皿。對照組：將ROBs放入線圈內90 min/d，但不通電；脈沖組：ROBs予50 Hz、0.6 mT、占空比為50%的PEMFS處理90 min/d；脈沖群組：ROBs予主脈沖頻率10 Hz、子脈沖頻率500 Hz、0.6 mT的PEMFs處理90 min/d。磁場處理完畢后，換含0.5% MTT的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜震蕩至紫紅色結晶全部溶解，于490 nm波長處測定吸光度(OD)。

1.3.3成骨性分化分析：將原代細胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中，每3天換液1次，待細胞生長至接近融合時加入成骨性誘導劑(L-抗壞血酸50 mg/L、β-甘油磷酸10 mmol/L和地塞米松1×10-8mol/L)，同時按實驗設計進行分組和磁場處理。成骨性分化指標包括：①ALP：電磁場分別處理3、6、9、12 d后將ROBs用胰蛋白酶處理并回收，后用細胞裂解液裂解細胞，胞內ALP活性按試劑盒按說明書操作，520 nm波長處測定OD值，蛋白濃度用BCA試劑盒測定。②鈣化結節(jié)數(shù)量和面積：成骨性誘導培養(yǎng)12 d后棄培養(yǎng)液，PBS液漂洗2遍，加入10%多聚甲醛固定10 min。棄固定液，加入0.2%茜素紅染色液(pH 8.9)于37℃條件下孵育1 h，三蒸水漂洗3遍，清洗干凈背景即可。照相記錄圖片結果，用Image-Pro Plus 6.0軟件量化分析。③基因表達分析：培養(yǎng)細胞經不同磁場處理3 d后，棄細胞培養(yǎng)液，PBS液漂洗2次。加入Trizol 750 μl裂解細胞并收集裂解液，加入氯仿200 μl混勻后室溫放置5 min，4℃ 12 000×g離心20 min。取上清，加入對半體積異丙醇，混勻后室溫放置30 min，4℃ 10 000×g離心20 min。棄上清，加入DEPC水配制的75%乙醇1 ml洗滌沉淀，4℃ 10 000×g離心10 min。棄上清，加入無RNA酶雙蒸水30 μl重懸沉淀，-80℃保存?zhèn)溆茫荒孓D錄制備cDNA，按照TaKaRa Prime ScriptTMReagent Kit說明書合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆茫籔CR擴增cDNA。按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ說明書添加PCR反應體系，進行40個循環(huán)擴增目的基因，RT-PCR數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCt法，合成引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

2 結果

2.1對細胞增殖的影響 各組處理3 d后行MTT分析，結果表明脈沖組和脈沖群組均可顯著刺激細胞增殖(P<0.01)，見圖1。

圖1 3組大鼠成骨細胞MTT檢測結果比較

2.2對ALP活性的影響 處理3 d后，脈沖群組ALP活性高于脈沖組及對照組(P<0.05)；處理6、9 d后脈沖組和脈沖群組ALP活性均高于對照組(P<0.01)；處理12 d后脈沖組和脈沖群組ALP活性略高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 3組大鼠成骨細胞堿性磷酸酶活性檢測結果比較

2.3對鈣化結節(jié)的影響 茜素紅染色結果顯示，脈沖群組和脈沖組鈣化結節(jié)數(shù)量多于對照組，鈣化結節(jié)面積大于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖3、表2。

圖3 3組大鼠成骨細胞鈣化結節(jié)茜素紅染色結果

2.4對基因表達的影響 各組處理3 d后用RT-PCR法檢測骨形成相關因子基因表達情況。脈沖群組和脈沖組ALP、BMP-2、RUNX-2和OSX基因表達水平均顯著高于對照組(P<0.01)。見圖4。

3 討論

近年來，PEMFs在骨科疾病中的應用引起了國內外學者的廣泛關注，其具有易操作、安全性高的特點[6]。研究表明，PEMFs不但可以預防和治療骨質疏松癥，而且對于緩解骨折后腫脹、骨痛、骨性關節(jié)炎等均有很好的療效[7-9]。PGEMFs是在PEMFs基礎上，改變了波形輸出，將原先單純的方波輸出切換為脈沖群加方波的形式輸出，為促進骨形成、預防和治療骨質疏松癥及促進骨折愈合提供了更為廣闊的研究思路。PEMFs對ROBs增殖與礦化作用已被諸多文獻報道[10-11]，本文旨在研究PGEMFs是否有同樣的作用。

MTT檢測結果顯示，PEMFs和PGEMFs分別干預ROBs 3 d后，均明顯促進了ROBs的增殖。且從圖1可以看出，脈沖群組的OD值高于脈沖組，雖然二者間差異無統(tǒng)計學意義，但也能說明PGEMFs對于ROBs增殖有明顯作用。

ALP活性是成骨性分化的早期指標，電磁場干預會增加ALP活性[12]。本研究在PEMFs和PGEMFs分別干預ROBs 3、6、9、12 d后行ALP活性檢測，結果顯示干預3 d后脈沖群組ALP活性與對照組比較差異即有統(tǒng)計學意義，體現(xiàn)了PGEMFs促進骨形成作用起效較早；干預6、9 d后脈沖組和脈沖群組ALP活性與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義，且脈沖群組ALP活性始終高于脈沖組，說明PGEMFs作用效果強。而干預12 d后脈沖組和脈沖群組ALP活性略高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義。

鈣化結節(jié)染色能夠顯示ROBs成熟礦化的情況，鈣化結節(jié)數(shù)量越多，說明新骨形成的能力越強。本研究結果顯示，脈沖群組和脈沖組鈣化結節(jié)數(shù)量多于對照組，鈣化結節(jié)面積大于對照組，差異有統(tǒng)計學意義。說明脈沖群組和脈沖組均可促進ROBs鈣鹽的沉積，有很好的新骨形成能力。脈沖群組與脈沖組相比，前者鈣化結節(jié)數(shù)量略多，鈣化結節(jié)面積略大，但差異無統(tǒng)計學意義，也可一定程度說明PGEMFs促進新骨形成的能力較強。

ALP、BMP-2、RUNX-2和OSX均是骨形成調節(jié)因子，新骨形成過程離不開這些因子的參與，可直觀反映骨形成活躍程度[13-14]。本研究圖4結果顯示，PEMFs和PGEMFs干預均可顯著增強ALP、BMP-2、RUNX-2和OSX骨形成相關因子的基因表達，差異有統(tǒng)計學意義。說明磁場干預可刺激骨形成相關因子的基因表達升高，從而起到正向調節(jié)作用，再一次證明磁場具有促進骨形成的作用。脈沖群組與脈沖組ALP、BMP-2、RUNX-2和OSX基因表達差異雖然無統(tǒng)計學意義，但是脈沖群組ALP、BMP-2、RUNX-2和OSX基因表達均高于脈沖組，說明PGEMFs正向調節(jié)能力更強，存在潛在優(yōu)勢。

綜上所述，PGEMFs可通過促進ROBs細胞增殖、提高ALP活性、增加鈣鹽沉積量及調節(jié)骨形成相關因子的基因表達，從而增加ROBs的成熟礦化，具有很強的促進骨形成能力。然而，PGEMFs是否也會增加大鼠峰值骨量、抑制或治療去勢大鼠的骨丟失及加速骨折愈合等作用尚有待課題組進一步研究。