松脂醇二葡萄糖苷促進體外培養成骨細胞骨形成的作用研究

吳思敏，孫 薇，高玉海，任 莉，陳克明

[作者單位] 730050 蘭州，解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫院骨科研究所(吳思敏、高玉海、任莉、陳克明)；610083 成都，西部戰區總醫院藥劑科(孫薇)

骨質疏松癥是一種嚴重的公共健康威脅，其患病率預計在未來幾十年內急劇上升，主要威脅絕經后婦女和老年人[1-2]。此外，全球范圍內一項大型研究報道，普遍或偶發骨質疏松性骨折的年度總成本比率超過了許多其他嚴重慢性病[3-4]。松脂醇二葡萄糖苷是杜仲的主要有效成分[5]。杜仲是杜仲科植物杜仲的干燥樹皮，具有補肝腎、強筋骨、安胎之功效[6]。現代藥理學研究表明，杜仲具有增加骨密度、改善骨小梁微結構、抑制骨量減少和骨強度下降等作用，因此是很多治療骨質疏松癥方劑的常用藥[7]。基于此點，我們提出可將松脂醇二葡萄糖苷運用于骨質疏松癥的治療。本實驗也表明適當濃度的松脂醇二葡萄糖苷對成骨細胞的骨形成確有促進作用，且進一步表明其也可能具有抗骨質疏松作用，但到目前為止關于松脂醇二葡萄糖苷抗骨質疏松作用的研究還很少。現將本實驗內容報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物 取出生3 d內的SPF級Wistar大鼠乳鼠，由解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫院動物實驗所提供(合格證號:SCXK甘2015-0002)。

1.2試劑和耗材 松脂醇二葡萄糖苷(廈門慧嘉生物科技有限公司，批號：DST180313-013，純度98.85%)，二甲基亞砜(DMSO)制備松脂醇儲備液(濃度為0.1 mol/L)儲存在-20℃條件下，培養液中DMSO的最終濃度<5‰。α-MEM培養基(Gibco公司，貨號：2090463)；胎牛血清(Biological Industries公司，貨號：04-001-1A)；青鏈霉素混合液(Solarbio公司，貨號：P1400)；胰蛋白酶-EDTA溶液(Solarbio公司，貨號：T1300)；膠原酶Ⅱ(Solarbio公司，貨號：C8150)；高效RIPA裂解液(Solarbio公司，貨號：R0010)；地塞米松(Sigma公司，貨號：D1756)；L-抗壞血酸(Sigma公司，貨號：A7631)；β-甘油磷酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，貨號：D106347)；ECL Plus超敏發光液(Solarbio公司，貨號：PE0010)；RNAiso Plus[寶生物工程(大連)有限公司，貨號：9109]；堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號：A059-1-1)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser[寶生物工程(大連)有限公司，貨號：RR047A]；TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ[寶生物工程(大連)有限公司，貨號：RR820A]；BCA蛋白濃度測定試劑盒(Solarbio公司，貨號：PC0020)；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑盒(Solarbio公司，貨號：P1200)；100、60 mm培養皿(Coring Costar公司，貨號：430167、430196)；35 mm培養皿(Thermo公司，貨號：150460)；6孔板(上海科進生物技術有限公司，貨號：10006)；96孔板(上海科進生物技術有限公司，貨號：10096)。CO2培養箱(Thermo Revco公司，型號：Forma371)；倒置相差顯微鏡(Olympus公司，型號：IX71)；臺式高速離心機(Heraeus公司，型號：Primo R)；高速冷凍離心機(湘儀離心機儀器有限公司，H1650R)；低速離心機(北京醫用離心機廠，型號：LD5-2A)；紫外分光光度計(惠普公司，型號：G1115A)；酶標儀(Bio Tek公司，型號：EPOCH)。

1.3實驗方法

1.3.1細胞培養和濃度篩選：①細胞培養[8]：取出生3 d內的SPF級Wistar大鼠乳鼠5只,置于75%乙醇中浸沒消毒處死。在無菌工作臺上分離出顱骨，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)漂洗，去除多余的結締組織。將顱骨剪碎，加入0.25%的胰蛋白酶，37℃水浴中輕輕震蕩消化15 min，重復2次；棄胰蛋白酶消化液，再加入0.1%Ⅱ型膠原酶，置于37℃水浴中震蕩消化，重復4～5次。后將膠原酶上清消化液合并，用200目細胞篩過濾，收集濾液，室溫下1500 r/min離心10 min，棄去上清液，收集沉淀，然后用含10%胎牛血清的α-MEM培養液重懸細胞沉淀，得到單細胞懸液。將細胞懸液調整至合適的密度轉入100 mm細胞培養皿中，置于37℃、5% CO2培養箱中培養，第2天更換培養液，之后每3天更換培養液1次，待細胞增殖融合至90%后，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，用于后續實驗。②濃度篩選：將培養好的成骨細胞以2400/孔的密度接種于96孔板中，每孔加培養液100 μl于37℃、5% CO2培養箱中培養。當細胞達到融合狀態(一般為1 d后),棄去培養基，配置新的培養液，再將之前已制備好的松脂醇二葡萄糖苷儲備液按濃度由高到低依次添加培養液，使得細胞培養液中松脂醇二葡萄糖苷終濃度依次為0、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9mol/L(每個濃度5孔)，再于培養箱中培養3 d測定ALP活性。設置空白組及實驗組，空白組中加入雙蒸水，實驗組為加藥組。向上述各組中加入1︰1的緩沖液與基質液，輕輕震蕩搖勻，置于37℃、5% CO2細胞培養箱中孵育15 min；向孵育好的各組細胞中加入顯色液并即刻混勻置于酶標儀上，在520 nm波長處測量吸光度。

1.3.2鈣化結節染色：將剛提取分離的成骨細胞以合適的密度接種于6孔板中，3 d更換培養基1次。待成骨細胞融合>90%時進行加藥處理，將培養基更換為含5%胎牛血清的α-MEM培養基，再加入合適濃度誘導劑β-甘油磷酸、L-抗壞血酸和地塞米松，誘導成骨細胞分化。顯微鏡下觀察細胞呈沙狀亮點聚集即為鈣化結節。棄去培養基，PBS液漂洗細胞3次；加入多聚甲醛固定液固定10 min，吸凈固定液后再用PBS液漂洗；加入適量茜素紅S染色液，37℃環境下避光孵育60 min，染色時間可根據肉眼觀察染色狀態進行調整；輕輕晃動觀察，待皿底出現深紅色斑點時棄去染色液，PBS液漂洗至無多余染色液，顯微鏡下觀察并拍照保存染色結果。

1.3.3基因表達檢測：①收集細胞：將培養好的細胞按照適當密度接種至60 mm培養皿中，隨機分為空白組和實驗組，培養24 h后棄去培養液，預冷PBS液洗滌3次，每皿加入適量的RNAiso Plus，冰浴裂解10 min后將細胞吹下收集在1.5 ml離心管中放于-80℃冰箱中備用。②RT-PCR分析：向上述融化的樣本中加入適量的三氯甲烷，12 000×g離心15 min。取上清再加入0.5倍體積的異丙醇，靜置30 min后12 000×g離心15 min。棄上清，保留離心管底部的白色沉淀，加入1 ml DEPC水配置的75%乙醇清洗沉淀2次，每次12 000×g離心15 min。棄上清，待離心管中的液體揮發完全后加入15～50 μl DEPC水溶解沉淀。按照TaKaRa Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明進行實驗。最終得到的cDNA樣品放于-80℃冰箱中備用。再按照TaKaRa Prime Ex TaqTMⅡ試劑盒說明操作。將混合好的PCR反應液按分組加入八連管中置于qPCR儀中按說明書設置反應條件。GAPDH作內參基因校正結果。引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列表

1.3.4蛋白表達檢測：將培養好經過加藥處理的細胞從培養箱中取出，棄去上清液，PBS液漂洗3次，加入適量的高效RIPA裂解液在搖床上冰浴裂解。裂解后13 000×g離心25 min，收集蛋白上清。應用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測樣品中的蛋白濃度，完成蛋白定量檢測后加熱變性。應用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠制備試劑盒配置分離膠和濃縮膠，待其完全凝固后上樣，通過電泳分離蛋白，然后按照相應的分子量轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上；轉移到含5%脫脂奶粉的封閉液中室溫封閉2 h，按照抗體說明在相應的一抗稀釋液中4℃孵育過夜；次日將PVDF膜復溫1 h，后用TBST洗滌5次，每次8 min。二抗1︰10 000稀釋，再按1︰10比例加入含5%脫脂奶粉的封閉液，室溫下搖床孵育2 h，后用TBST洗滌4次，每次10 min。用ECL Plus超敏發光液在暗室中進行顯色。利用Image J軟件掃描膠片，Adobe Photoshop CS5處理條帶。

2 結果

2.1對成骨細胞ALP活性的影響 松脂醇二葡萄糖苷處理成骨細胞的最佳濃度為1×10-6mol/L(P<0.01)。見圖1。

2.2對鈣化結節的影響 濃度為1×10-6mol/L的松脂醇二葡萄糖苷處理成骨細胞后,其鈣化結節形成程度明顯高于空白組。見圖2。

圖2 松脂醇二葡萄糖苷對成骨細胞鈣化結節的影響

2.3松脂醇二葡萄糖苷對成骨細胞成骨相關基因表達的影響 松脂醇二葡萄糖苷介導的BMP-2、RUNX-2和OSX基因表達量均顯著增加(P<0.05或P<0.01)，見圖3。

圖3 松脂醇二葡萄糖苷對成骨細胞成骨相關基因表達量的影響

2.4松脂醇二葡萄糖苷對成骨細胞成骨相關蛋白表達的影響 松脂醇二葡萄糖苷處理后成骨細胞成骨相關蛋白BMP-2、RUNX-2和OSX表達量均有所增加。見圖4。

圖4 松脂醇二葡萄糖苷對成骨細胞成骨相關蛋白表達的影響

3 討論

骨質疏松癥是一種與衰老相關的疾病，困擾著全球數百萬人[9]。隨著人們的壽命越來越長，與壽命延長相關的是各種低創傷性骨折發生率升高和其后果[10]。近年最被大眾所接受的骨質疏松癥治療藥物為雙膦酸鹽，但雙膦酸鹽口服吸收性非常差[11]。近年人們對中草藥在骨質疏松癥治療方面的功效產生了濃厚的興趣，中草藥成本低、易獲取、毒副作用小，或將成為治療骨質疏松癥的重要方法。據報道杜仲能夠調節骨代謝，而松脂醇二葡萄糖苷是杜仲的主要有效成分，體外細胞實驗表明松脂醇二葡萄糖苷可促進成骨細胞的成骨性分化，因而有成為抗骨質疏松新藥的潛力[12]。

ALP活性是成骨細胞早期成熟和分化的標志，可反映骨形成狀況，其表達隨著細胞分化的成熟而增強。若一種藥物可以增強成骨細胞ALP活性，說明其具有促進骨形成的作用[13]。本實驗先以ALP活性為指標檢測成骨細胞活性，結果表明，1×10-6mol/L松脂醇二葡萄糖苷處理后ALP活性最高。鈣化結節是成骨細胞礦化機制形成的標志。1×10-6mol/L松脂醇二葡萄糖苷處理成骨細胞后，鈣化結節形成顯著增多,明確了松脂醇二葡萄糖苷會影響成骨細胞骨形成。同時，本實驗也檢測了松脂醇二葡萄糖苷促進體外培養成骨細胞骨形成過程中相關蛋白、基因的表達水平，結果顯示1×10-6mol/L松脂醇二葡萄糖苷處理可使成骨細胞成骨相關蛋白基因BMP-2、RUNX-2與OSX表達水平顯著升高。眾所周知，OSX位于RUNX-2的下游，其蛋白表達量會根據RUNX-2的變化而變化。在本實驗中，經松脂醇二葡萄糖苷處理后，成骨細胞RUNX-2與OSX的變化確實一致。所以，松脂醇二葡萄糖苷可促進成骨細胞的增殖和分化。

綜上,1×10-6mol/L松脂醇二葡萄糖苷可促進體外培養大鼠乳鼠顱骨成骨細胞骨形成，增加鈣化結節面積，并可升高成骨相關蛋白基因BMP-2、RUNX-2及OSX表達，但具體機制還需進一步研究。